149282. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin kinyerésére nyers vizes szervkivonatokból

149.282 heparin túlnyomó részét magával viszi. Ilyen fehérje, ami a heparint mag tudja kötni, és savanyításra koagulál, általában jelen van a megfelelőien előállított kivonatban. A heparin-fehérje csapadékot ülepítéssel és centrifugálással tömörítik, és ebből esetleg oldószeres szárítás és zsírtalanítás után 0,1—1,0 NE/mg hatóanyag tartalmú nyers terméket lehet kapni, aminek tehát rnég több, mint 99%-a fehérje és egyéb szennyezőanyag. Jelenleg az az egyetlen, gyakorlatilag is alkalmazható ipari eljárás, amivel a heparint a nyers szervkivonatokból ki tudjuk nyerni. Az eljárás egyszerűsége mellett azonban sok bizonytalanságot rejt magában, melyek az ipari gyártásban rendkívül nagy veszteségeket okoznak, eltekintve attól a hátránytól, hogy a kinyert termék tisztasági foka ennyire alacsony. Ez a bizonytalanság abban nyilvánul meg, hogy a folyamatos gyártás során a kitermelés szeszélyesen ingadozik 30—70% között, és bármily gondosan próbáljuk az autolízis körülményeit standardizálni, a savas kicsapással nyert heparin-fehérje súlya is rendkívül széles határok között ingadozik (3 kg—50 kg/1000 liter nyers kivonat). Emellett a kivonat heparintartalmámak gyakran igen jelentékeny része, — 2'0— 40%-a — kiosapás után is az oldatban marad, tehát elvész. Ez a veszteség csökken, ha a nyerskivonatban több a vivő fehérje, ami elérhető azzal, ha autolízis helyett intenzív proteolízisnek vetjük alá a szervet, mint azt az U. S. P. 2 587 924 számú szabadalom szerint E. M. Taylor és munkatársai leírják. Ők a nyers kivonatot a tüdőnek tripszin, vagy más proteolitikus enzimmel csaknem teljes feloldásig történő emésztése útján állítják elő. Az eljárás nyilván költségesebb az eredeti Charles Scott-féle autolízises módszernél, de a kivonatban magasabb a heparin nyeredéik, és az így előállított kivonatból megsavanyítással biztosabban kicsapható a heparin, a sokkal nagyobb tömegű fehérje kíséretében. Ez olyan nagy rncnynyiségű, hogy a szerzők javaslata szerint az így nyert fehérje-heparin csapadékból a kísérő fehérjék nagy részét egy, külön lépésiben célszerű eleltávolítani úgy, hogy a savas csapadékot lúg hozzáadásával ismét oldatba visszük, majd 65 C°ra melegítve, CaCl2 oldatot adunk hozzá. Ekkor az inert fehérjék egy része koagulál, ezt centrifugálással különválasztjuk, és a tisztább vizes oldatban megkapott heparint kétszeres térfogat alkohol hozzáadásával kicsapjuk. A gyakorlat szerint úgy az eredeti Charles— Scott-féle autolízises eljárással, mint a Taylor-féle proteolízissel készült kivonatoknál egyaránt igen súlyos bonyodalmakat okoz, ha a feldolgozott szerv zsíros. Ez a kivonaitolás alatt a kivonatba emulgeálódik, és savas kicsapáskor a kiváltott csapadékra tapadva, annak fajsúlyát olyan mértékig befolyásolja, hogy a szokásos 24 órás ülepítés után nemcsak az üledék térfogata lesz nagy, de gyakran előfordul, hogy a csapadék kettéválva, egyik része üledék, másik része felül úszó formában helyezkedik el. Megállapítható, hogy a heparingyártásnak ez a nagy volumenekkel dolgozó szakasza, amelyik a gyártás rentabilitását döntően befolyásolja, nincs optimálisan megoldva. A nagy térfogatú nyers léből heparinnak oldószereikkel történő kicsapása vagy alkilamintartalmú oldószerekkel történő extrakciója rendkívül költséges, a Charles—Scottféle módszer szerint, megsavanyítással, fehérjeheparin csapadék formában való leválasztása pedig igen bizonytalanul és rossz hatásfokkal megy, és jobb hatásfokkal csak a magas vivőfehérje tartalmú proteolitikus enzimmel, költségesebb úton előállított nyers kivonatok esetében alkalmazható. Ez esetben is számolnunk kell azzal, hogy a kísérői eh érj ék nagy tömegét egy külön beiktatott tisztítási lépéssel kell eltávolítani, és e művelet után a nyers heparint ugyancsak oldószeres kicsapással kell kinyerni. Amellett ezeket a módszereket rendkívül bizonytalanná teszi a feldolgozott szerv zsírtartalma. A találmány célja az, hogy a heparint bármilyen eredetű nyers kivonatból mindig biztonságosan reprodukálható módon, minél kevesebb kísérő szennyezés mellett, — szerves oldószerek alkalmazása , nélkül ki tudjuk nyerni. Ezért beható vizsgálat alá vettük a nyerskivonat viselkedését és kerestük a Charles—Scott által bevezetett egyszerű savas kicsapásnál fellépő kitermelés ingadozások és veszteségek okait. Ennek oka nyilván az, hogy a kicsapható vivőfehérjék mennyisége és tulajdonsága igen változatos. Ezek az autolízis során képződő bomlástermékek ugyanis sok, az eljárással nem befolyásolható tényező függvényeit, mint pl. a szerv előélete, tárolási körülményei, fertőzöttségének foka stb. Egy másik probléma, hogy a niegsavanyítáekor leváló vivőfehérje nemcsak a heparint, hanem a kivonatban levő — gyakran igen nagy mennyiségű kolloid és lebegő szennyeződéseket is magával viszi. E szennyeződések nagy része szöveti maradványokból és emulgeált zsírokból áll, ezek tehát felesleges és igen kellemetlen ballaszt-anyagot jelentenek. A találmány, szemben az eddig ismeretes eljárásokkal, olyan módszert ismertet, amely előbb a vivőfehérjék nagy részét és a nagy tömegű inert szennyeződést az oldatból eltávolítja, de úgy, hogy a heparin visszamaradjon, majd az így megtisztított oldatból a heparint —• ami már savanyítással nem csapható ki —, nem a költséges oldószeres kicsapással, hanem egyszerű leválasztással nyeri ki. A találmány, szerint a fent említett kísérőanyagok a nyerskivonatból eltávolíthatók úgy, hogy a kivonatot megfelelő mennyiségű CaCl2-al 8,5—10,0 pH-határok között, intenzív hőkezelésnek tesszük ki. Míg a 60 C°-ra való melegítés csak részleges koagulálást eredményez, és a nyers lé zavaros marad, addig 100 C°-on, vagy afölött, megfelelő körülmények között a Ikisérőanyagok olyan tömör csapadék formában koagulálódnak, hogy erről tiszta, átlátszó oldatot lehet, úgyszólván veszteségmentesen ledekantálni. Ezt a tiszta oldatot azonban hiába savanyítjuk meg, esetleg kolloid zavarosság fellép, vagy némi csapadék kiválik, de a heparin oldatban marad, nyilvánvalóan azért, mert a vivő fehérjéket is eltávolítottuk. Megállapítottuk azonban, hogy - az így előkezelt kivonatból a heparin igen előnyösen leválasztható, mindössze némi kismolékulájú fehérje ki-