148273. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adrenokortikotrop hormon (ACTH) tisztítására

Megjelent: 1961. június 1. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 148.273. SZÁM 30. h. OSZTÁLY — GO—740. ALAPSZÁM SZOLGALATI TALÁLMÁNY Eljárás adrenocorticotrop hormon (ACTH) tisztítására Gyógyszeripari Kutató Intézet, Budapest Kovácsn é, Szabó Ilona A bejelentés napja: 1960. február 9. Póíszabadalom a 144.928 lajstromszámú törzsszabadalonihoz A 144.928 1. sz. törzsszabadaloim eljárást ismertet purum ACTH hormon előállítására, melynek értelmében a nyers hormon frakcionált kisózással tisztítható szerves savval megsavanyított vizes oldatból oly módon, hogy 50 C° feletti hőmérsékletre való melegítés után az oldathoz 2—6%, előnyösen 3% NaCl-t adunk, majd a 30 C°-ra lehűtött oldat lecentrifugálásával a ballaszt anyagokat eltávolítjuk, végül az oldatból a hormont NaClnak, célszerűen telítésig való adagolásával, kicsapjuk, majd a csapadékot a folyadéktól elkülönítjük. A törzsszabadalom szerinti eljárás előnye, hogy könnyen és gazdaságosan kivitelezhető egyszerű technológiai lépesekkel, ballasztanyagoktól és az adiuretin, valamint az Oxitocin túlnyomó részétől mentes ACTH készítményt kapunk. Az üzemi gyártás során felhasználásra kerülő hipofízis mellsőlebeny különböző minősége miatt a szaba dal óimban leírt eljárás alapján nem mindig lehetett biztosítani a mellékhatásoktól (adiuretin, Oxitocin) mentes hormon előállítását. Vizsgálataink során úgy találtuk, hogy a törzsszabadalom szerinti eljárás továbbfejleszthető és a jelzett nehézségek nem jelentkeznek, ha beiktatunk egy további tisztítási lépést a kisebb molekulasúlyú polipeptidek eltávolítására. A vizsgálatainkban arra a felismerésre jutottunk, hogy egy triiklórecetsavas tisztítási lépés beiktatásával a még visszamaradt adiuretin és Oxitocin szennyezések eltávolíthatók és egyidejűleg a hatóérték (E/mg) is növekszik. Eljárásunk szerint a 144.928 1. sz. szabadalom szerint előállított purum ACTH-t, mely Corticotropin-A-nak felel meg, szerves sav híg vizes oldatában feloldjuk és 2—25%-nyi, előnyösen 7%-nyí mennyiségű triklórecetsavat adunk hozzá. Ekkor az ACTH lecsapódik és oldatban marad az alacsonyabb molekulasúlyú adiuretin és Oxitocin. A csapadékot 0 C° és —20 C"-közötti, előnyösen —12 C°-os absz. acetonnal mossuk a triklórecetsav eltávolítása céljából, majd 0,1 n HCl-ben feloldjuk ós 15-szörös térfogatú —10 C°-os absz. acetonnal kicsapjuk. Centrifugálással elkülönítjük a Corticotropin-A hormont. E készítmény hamutartalma a triklórecetsavas kezelés hatására kb. 80—90%-kal lecsökken a törzsszabadalomban leírt purum ACTH hamutartalmához képest. Adiuretikus hatása és Oxitocin tartalma nem haladja meg az ACTH egységenként a 0,1 adiuretin és Oxitocin egységet, mely a nemzetközi előírásoknak megfelel. A triklőrecetsav alkalmazása csak a törzsszabadalomban leírt eljárási lépések után célravezető, mert kísérleteink szerint a frakcionált ki sózás elhagyásával a triklórecetsavas tisztítási lépés nem vezet sem az ACTH hatóérték növelésére, sem az adiuretin és Oxitocin olyan mértékű eltávolítására, hogy a kapott termék gyógyászati célra megfelelő legyen. Az erősen hűtött aceton alkalmazása igen lényeges, mert a triklőrecetsav jelen körülmények között, meg nem felelő hűtés esetén nagymértékben lebonthatja az ACTH molekulát és így klinikailag csekély hatőértékű anyagot kapnánk. A triklórecetsavas tisztítási lépés olyan esetben is eredményes, amikor a törzsszabadalomban leírt eljárás szerint kapott ACTH purum "készítmény alacsony hatóértékű és mellékhatásokat is mutat-Ilyen esetben a már leliofilizált kész terméket tiszti tj ük triklórecetsawal. Példák: 1. 2 g crudum ACTH-t feloldunk 10.0 ml 2%-ÜÖ ecetsavban és állandó kevertetés mellett 3 g NaClt adagolunk az oldathoz. A zavaros oldatot 10 percre forró vízfürdőbe helyezzük, mire az oldat kitisztul. A forró oldatot azután állandó keverés mellett lehűtjük és a közben leváló csapadékot