147773. lajstromszámú szabadalom • folyamatos eljárás B12-vitamin fermentációs előállítására
2 147.773 A nern-steril fermentációs módszer bevezetése igen jelentős gazdasági előnyökkel jár. A módszer célszerű alkalmazása lehetővé teszi, hogy az 1 m3 hasznos fermentor-térfogatra eső, naponta nyerhető fermentált lé mennyisége a 6—12-szeresre, a fermentációval kapcsolatos munka termelékenysége az 5—6-szorosára, az üzem biztonsága pedig a sokszorosára emelkedjék (fertőzések okozta kiesések szempontjából) a steril, szakaszos fermentációs módszerrel összehasonlítva. Ennek megfelelően a termelt Bi2-vitamin önköltsége 30— 35%-kal csökken. A felfőzött tenyészet lényegesen érzékenyebb fertőzéssel szemben, mint az élő tenyészet. Eljárásunkat tehát valószínűleg az teszi lehetővé, hogy a tenyészetben egy termolabilis antimetabolit van jelen, amely az antibiotikumok zömével ellentétben agardiffúziós módszerrel csak minimális gátlást mutat, agar-hígításos módszerrel azonban kimutatható. A fermentáláshoz előnyösen Propionibacterium freudenreichii vagy Propionibacterium shermanii törzseket használunk. Találmányunk szerint eljárva a táptalajt 10—30 percig 100 C°-ra melegítjük, hogy a mikroorganizmusok vegetatív alakjait elpusztítsuk. Természetes azonban, hogy steril táptalaj is alkalmazható. Eljárhatunk úgy is, hogy a tápanyagokat kevés vízben oldva felfőzzük (esetleg sterilizáljuk) és nem-steril vízzel, pl. csapvízzel egészítjük ki a táptalajt. Eljárhatunk úgy, hogy az inokulumot több lépcsőben állítjuk elő és csak az első 1—2 lépcsőben tartjuk be a sterilitás szabályait. Igen előnyös, ha a steril inokulum-készítést is folyamatosan végezzük. A fermentációt tetszés szerint nyitott edényben (üveg, saválló acél, hőagyag stb.) végezzük el. A fermentáció lehet folyamatos, vagy félfolyamatos. A kivitelezéskor a táptalaj adagolást folyamatosan végezzük fermentáció közben, illetőleg folyamatosan vezetjük el a fermentlevet. Fontos, hogy kellő mennyiségű inokulumot adjunk a fermentációba. Az eljárás további részletei a példákban találhatók. Példák: 1. 500 ml-es főzőpohárba töltünk 200 ml propionibacteriumos fermentációs levet, amely a 143.834 sz. magyar szabadalom szerint készült és hozzáadunk 200 ml steril táptalajt. A pohár tartalmát összekeverjük és a nyitott poharat 28— 30 C°-on tartjuk. 24 óra múlva a párolgási veszteséget pótoljuk, a pohár tartalmának a felét eltávolítjuk és 200 ml steril táptalajjal pótoljuk. Ezt az eljárás naponta megismételjük 4 héten keresztül. Számottevő fertőzés mindvégig nem lép fel. A naponta levett tenyészethez 1 /xg/ml 5,6-dimetilbenzimidazolt adunk és másnap mérjük a Bi2-vitamin aktivitást E. coli lemezes módszerrel. Az aktivitás 1,5—2,5 /tg/ml közt ingadozik, anélkül, hogy csökkenő tendenciát mutatna. 2. 2 m3 -es fermentorban 1,6 m3 táptalajt fermentálunk steril körülmények közt. A 96. órától kezdve egyenletes ütemben hozzáfolyatunk óránként 40 1 steril táptalajt és túlfolyó segítségével ugyanennyi fermentációs levet lebocsátunk. A lebocsátott folyadékot nem-steril tartályban gyűjtjük és ha megfelelő mennyiség összegyűl, 1 /xg/ml dimetilbenzimidazolt adunk hozzá és további 36—48 óráig hagyjuk állni, hogy a baktériumokban levő B-faktornak Bi2-vitaminná való átalakulása végbemenjen. 1,5—2 /tg/ml közti Bj2-vitamin hozamot kapunk, tehát ugyanannyit, mint szakaszos fermentációnál. 3. 50 l-es üveglombikba töltünk 40 1 120 órás, az 1. példában megadott módon előállított fermentációs levet. Ehhez egyenletes ütemben hozzáfolyatunk 24 óránként 28—30 1 steril táptalajt, míg a felesleget túlfolvón levezetjük. Ilyen módon is a fermentáció gyakorlatilag korlátlan ideig folytatható, anélkül, hogy számottevő fertőzés lépne fel. A Bi2-vitamin aktivitás 1,5—2 /xg/ml körül mozog. 4. 2 m3 -es saválló acélfermentorban 1600 1 steril fermentációs folyadékot állítunk elő. Az oltás utáni 96. órától kezdve naponta 800 l-t átnyomatunk egy nem-steril tartályba vagy készülékbe, ott 20 percig 90 C°-on tartott, majd lehűtött táptalajjal kiegészítjük 1600 l-re. 2 /xg/ml 5,6-dimetilbenzimidazolt adunk hozzá és három napig tovább fermentáljuk nem-steril körülmények közt. Lényeges fertőzés az utófermentáció folyamán, nem lép fel és az eljárás addig folytatható, míg a steril törzstenyészet be nem fertőződik. 1.5—2 ug/ml B12 -vitamin aktivitás mutatható ki. 5. 2 m3 -es fermentorban 1600 1 96 órás steril Propionibacterium-tenyészetet állítunk elő és ezt három nem-steril edényben egyenlő mennyiségben osztjuk el. Az edények tartalmát 20 percig 100 C°-on tartott és lehűtött táptalajjal 1600— 1600 l-re egészítjük ki, prekurzort (5,6-dimetilbenzimidazolt) adunk hozzá és tovább fermentálunk 2—4 napig. Ekkor sem mutatkozik lényeges fertőzés és lényegében ugyanolyan eredményeket kapunk, mint steril fermentáció esetén, így a steril fermentációs tér háromszorosára növelhető a hasznos fermentációs térfogat. A B-vitamin aktivitás 1,5—-2 /xg/ml. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás Bi2-vitamin előállítására Prooioníbacterium-családhoz tartozó mikroorganizmusokkal való fermentálás útján, amelyre jellemző, hogy a fermentlé mennyiségére számított legalább 25% steril inokulummal való beoltás után folyamatosan vagy félfolyamatosan fermentálunk nem-steril körülmények közt. 2. Az 1. igénypontban leírt eljárás kiviteli módja, amelyre jellemző, hogy steril fermentációt folyamatos nem-steril fermentációban végzett inokulum-készítéssel kombináljuk. 3. Az 1—2. igénypontokban leírt eljárás kiviteli módja, amelyre jellemző, hogy az inokulumot olyan táptalajjal egészítjük ki, amelyben a baktériumok vegetatív alakjait pusztítjuk csak el. 4. Az 1. igénypontban leírt eljárás kiviteli módja, amelyre jellemző, hogy az inokulumot több lépcsőben állítjuk elő és csak az első lépcsőnél tartjuk be a sterilitás szabályait.
