147627. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamin és a hasznosítható B12 vitaminszerű faktorok egyidejű kinyerésére, ezeket tartalmazó koncentrátumokból
147.627 3 mennyiségben, ugyancsak tisztán a kristályos F III-at, végül tiszta koincentrátum formájában a nem kristályosodó etiokobaiaminkarbonsavat, a B- és X-faktort és valamennyitől elkülönítsük az egyelőre haszontalannak ismert E- és A-faktorokat. Az alapszabadalom eljárásának az első részét, a fenol-kloroformos kirázási sorozatot a fenti elvék alkalmazásával a következőképpen alakítjuk át: A törzsoldat pH-ját ecetsavas puffer segítségével 4,5-re állítjuk és kirázzuk a törzsoldat 20%-át kitevő 1 : 6 arányú fenol-kloroformmal, majd a leválasztott oldószeres fázist kimossuk a törzs áldat 60%-át kitevő — puff érrel 4,5 pH-ra állított — deszt. vízzel. A lebocsátott oldószeres fázis sok barna inert szennyeződés mellett magával viszi gyakorlatilag az összes „E-faktort" és némi B-faktort, míg a kiindulási Bi2-vitaminnak 1%-on aluli mennyiségét tartalmazza. (Ez utóbbi igen váratlan jelenség, mert ha első1 közelítésben csak azt vesszük tekintetbe, hogy a Bi2-vitamki az 1:6 fenol-kloroformban kb. 50-szer jobban oldódik, .mint a vízben, úgy a számítások ezerint a fenol-kloroformos fázis a Bi2-vitaminnak 85%-át kellett volna magával vigye. A fentiek szerint eljárva azonban a vizes fázisba átoldódott fenol és az oldószeres fázisba átoldódott inert szennyeződések hatására az, első oldószeres frakció alig vitt 'magával B^-vitamint.) Ezután a kirázáshoz nem 1 : 6, hanem 1 : 5 összetételű fanol-kloroformot használunk és úgy a törzsoldatinak, mint az előzően használt mosóvíznek is a pH-ját 4,5-ről, — 10%-os Na-lúg hozzáadásával — 8,5-re emeljük, majd hozzáadunk 1% fenolt és ilyen körülmények között a törzsoldatot a térfogatának kétszer 30, majd egyszer 25%-át kitevő fenol-kloroformmal rázzuk ki. A kinyert szerves fázisokat azonban nem egyesítjük, hanem sorban átrázzuk velük az előzőben használt, de már átlúgosított mosóvizet, majd a leválasztott oldószer-frakciók mindegyikét az előző és egy frissen készített ugyanilyen térfogatú 8,5 pH-ra állított lúgos mosóvizén, vezetjük át, amelyekbe azonban 2% fenolt is feloldottunk. A lúgos közegben való emulzióképződés csökkentésére célszerűnek • találtuk a mosóvizekhez 1% Na-acetát hozzáadását. Az így nyert 3 fenol-kloroformos frakciót, mely az összes B| 2-vitaminnak mintegy 90%-át tartalmazza — egyesítjük és továbbiakban az alaps.zabad.alom szerint eljárva belekeverünk 4 kg Brockmann-féle alumíniumoxidot, majd 5 1 absz. acetont. Fél órai keverés után az elegyet — célszerűéin 2—3 részre osztva, zsugorított üvegszűrőkre (G 3) visszük, ott. absz. acetoninal alaposan átmossuk, majd leoldás céljából. 60%-os acetont rétegezünk a szűrőkön levő vörös színű alumíniumcxidra. A lefolyó vörös színű eluátumot külön felfogjuk és annyi absz. acetont adunk hozzá, míg éppen megzavarosodik. Példánkban az elucióra felhasználtunk 6,2 1 60%-os acetont és a nyert eluátumhoz hozzáadtunk 22 1 absz. acetont. 24 óra múlva a hűtőszekrényben tartott elegyből a kivált kristályokat leszűrjük és kevés absz. acetonnal átmosva 90 C°-os szárítószekrényben 10% nedvességtartalomig szárítjuk. Nyeredék 94,6 g USP. XV. követelményeinek megfelelő, tiszta B12-vitamim (86%-os kitermelés). Az aeetonos anyalúgban, marad mintegy 3 g Bi2 -vitamin és 6 g B-faktor, amiből bepárolás után, pl. a 144.069 sz. magyar szabadialom szerint eljárva a maradék B12 -vitamin kinyerhető. A kiindulási anyag B12-vitamin-tartalmának azonban kb. 10%-a a mosóvizekben maradt. Ugyanitt van az F III. tartalomnak is mintegy 30—40%,-a, a többi része pedig a kiindulási törzsoldatban maradt, míg az etiokobalaminkarboinsav teljes mennyiségében a törzsoldatban, és az első mosóvízben van. (Ez annak a következménye, hogy a találmány szerint a törzsoldatot és a mosókat az 1:5 fenol-kloroformos átrázás előtt lúgosra állítottuk. Ezzel az etiokobalaminkarboirisav megoszlási hányadosát — mely semlegesen 1 : 7 —, nagymértékben lecsökkentettük úgy, hogy az a felhasznált mennyiségű szerves oldószerrel nem volt kivonatolható.) Az oldószeres kirázás folytatásaként most a mosóvizeket, kirázzuk, eredeti sorrendjükben — még egyszer 30% 1 : 5 arányú fenolkloroformmal. Ezzel a kirázással kioldottuk a mosóvizekben maradt Bi2-vitamint, de kb. azonos mennyiségű F III-nak keverve. Az eljárás szerint ezt az „oldószeres keverékírakciót" nem dolgozzuk fel tovább, hanem a következő gyártásnál felhasználjuk az első 30%-os 1 : 5 arányú fenol-kloroformos kirázásra. (így hosszadalmas feldolgozás nélkül a B ^-vitamintartalomnak minden veszteségét elkerültük, anélkül, hogy a következő gyártásmenetben az 1 : 5-ös fenol-kloroformos kirázás hatásfokát valamivel is lerontanék, mert a kiindulási törzsoldat összetétele is körülbelül ugyanaz, mint e „Keverék-frakció" faktorösszetétele.) A következőkben ismét megváltoztatjuk az összes használt mosóvizek pH-ját úgy, hogy azokat 10%-os sósavval pH 4,5-re állítjuk és most fordított sorrendben, tehát a legvilágosabb színű, utolsó mosóval kezdve, végigrázzuk őket 2><30% térfogatú 1 : 2 összetételű fenol-kloroformmal. Utoljára mindkét oldószer frakcióval kirázzuk a lúgosán hagyott törzsoldatot is, amit végül kirázunk még 20% friss. ,1:2 összetételű fenol-kloroformmal. A 3 oldószeres frakciót egyesítjük és a törzsszabadalom 5. igénypontja szerint 4 kg Brockmann-féle Al2 03-ból absz. acetonnal készült oszlopra öntjük fel. Az oldószer átfolyása után az oszlopot absz. acetonnal átmossuk, majd 80%~os acetonnal eluáljuk. A megg5"űjtött eluátumhoz zavarosüdásig absz, acetont adunk, majd az elegyet hűtőszekrénybe tesszük. Pár nap: után leszűrve kinyertünk 62 g F III. kristályt, ami nem tartalmaz kimutatható mennyiségű Bi2-vitamint, (A mosóvizek átsavanyításával az F III. és a,z etiokobalaminkarbonsav megoszlási hányadosát az oldószeres fázis javára eltoltuk. így az. oldószeres átrázással ezeket kvantitatíve ki tudtuk emelni, ezért most a piszkossárga színű üres mosóvizeket elönthetjük. Az utoljára, kirázott, lúgosán hagyott törzsoldatban lemarad a savanyú mosókból összegyűjtött kevés etiokobialaminkarbonsav, míg az F III. tartalmát az. 1 : 12 arányú fenol-kloroform teljes mennyiségben, kiemelte.) A törzsoldatot, amiben ismét együtt van az etiokobalaminkarbonsav teljes mennyisége, de sem Bi2-vitamint, sem F III-at nem tartalmaz, sósavval iesemlegesitjük és a benne oldott fenolt kloroformos kirázással kimossuk, majd az oldószer
