147324. lajstromszámú szabadalom • Egyszerű eljárás tripszin kinyerésére insulinmentes hasnyálmirigy maradékból

2 147.324 zása; végül 3. .a tripszintartalmú kivonatok tisztításának első lépése, amelynek célja az enzim töményítése, az irodalomból ismert kisózásos frakcionálási módszereknél előnyösebben oldható meg. Kísérleteink során azt találtuk, hogy a tripszin-és insulinmentes hasnyálmirigymaradékból 25—45, előnyösen 30—40 térfogatszázalék alkoholtartalom jelenlétében is jó hozammal kivonatolható, ha a kivonási műveletet szobahőmérsékleten vízoldható szervetlen, vagy szerves só hozzáadásával mérsékelten savanyú vegyhatású közegben, pH 5,0— 6,5 értékhatárok közt végezzük. Megállapítottuk továbbá azt is, hogy az így nyert kivonatokból a tripszin alacsony hőmérsékleten a szerves oldószer koncentrációjának növelésével jól kicsapható s elkülönítése után kisózásos frakcionál ássál egy lépésben oly mértékben tisztítható, hogy a kapott termék fehérjebontó hatóképessége megegyezik a kristályos tripszinével. A találmány értelmében tripszin insulinmentes hasnyálmirigymaradékból történő előállításakor úgy járunk el, hogy az 50—80 térfogatszázalék alkoholtartalmú oldószerrel kivont erősen savanyú vegyhatású szervmaradékct vízzel keverjük, pl. nedves súlyára számított kétszeres, két és félszeres térfogatú csapvizet adunk hozzá, s az anyagot késes őrlőgépen finomra őröljük. A 25—45, előnyösen 30—40 térfogatszázalék alkoholt tartalmazó keverékhez ezután vízoldható szervetlen, vagy szerves sót adunk célszerűen 0,15—1,0 mól literenkénti mennyiségben, s a pHrt .4,0—6,8, előnyösen 5,0—6,5 közé állítjuk be. Sóként használhatunk nátriumkloridot, nátriumszulfátot, ammóniumkloridot, am'móniumszulfátot, stb. előnyösebb azonban, ha pufferihatású sót, pl. nátriumacetátot, vagy amnióniumaeetátot alkalmazunk, mellyel egyben a pH-t is beállíthatjuk. Szobahőmérsékleten állandó keverés közben történő 2—10 órás időtartamú kivonás után a szervmaradékot centrifugálással elkülönítjük, s a fölöttes enzimtartalmú levet -4-5 C° alá, pl. — 15—0 C° közti hőmérsékletre, előnyösen — 5 C°-ra hűtjük. A zsírnemű szennyezés eltávolítása után a tisztára szűrt oldatból a jäzerves oldószer koncentrációjának növelésével csapjuk ki a tripszint. Szerves oldószerként használhatunk metanolC etanolt, vagy aoetont, a kicsapást 50—75 térfogatszázalék koncentrációhatárok között, célszerűen kétszeres mennyiségű oldószerrel végezzük. A kapott csapadékot kis mennyiségű vízben oldjuk és fagyasztott állapotban szárítjuk. A fentiekben vázolt egyszerű úton kapott tripszinpreparátumok hozama átlagosan 25%-kal múlja felül az irodalomban ismertetett •különböző sok lépéses és hosszadalmas eljárások termelését. Eljárhatunk azonban úgy. iSj hogy az alkoholos lecsapással nyert enzimkészítményt kénsavas oldás után, ismert módon kisózással frakcionáljuk. Ezen az úton olyan terméket kapunk, amelynek hatóértéke megegyezik a kristályos tripszinével. Példák: 1. 2,5 kg kevert (sertés és marha), előzőleg sósavas etilalkohollal insulinra kivont hasnyálmirigymaradékhoz 6,25 liter csapvizet adunk, s a szervmaradékot rövid időtartamú késes őrlésnek vetjük alá. A keverék alkoholkoncentrációját ezáltal 38 térfogatszázalékra állítjuk be. 1.31,2 g szilárd nátriumacetát hozzáadásával (0,2 mol/1) a pH-t 5,0-ra állítjuk be s szobahőmérsékleten 8 órán át, állandó keverés közben 'kivonatoljuk. A kivonási művelet befejeztével a szervmaradékot centrifugálással eltávolítjuk, az enzimtartalmú fölöttes levet pedig szűrés után (a zsírnemű szennyezéseket különítjük el ezáltal) —5 C°-ra hűtjük. A 7 liter térfogatú enzimtartalmú kivonatból 14 liter —10 C°-ra hűtött metilalkohollal csapjuk ki a tripszint. 6—18 órás hűtött térben történő tárolás közben a csapadék jól kiülepszik. Centrifugálás után az alkoholos üledéket 300—400 ml vízben oldjuk és fagyasztott állapotban szárítjuk. Az így kapott nyerstermék súlya 3,5 g; Anson-féle Hb egységekben mért aktivitása 2,6 [TU] 2. 2 kg kevert, előzőleg S0 térfogatszázalékos foszforsavas etilalkohol insulinra kivont hasnyálmirigymaradék alkoholtartalmát 5 liter csapvíz hozzáadásával 36 térfogatszázalékra csökkentjük le. Néhány percig tartó rövid időtartamú késes őrlés után a reakcióelegybe literenként 30 g konyhasót .mérünk és a pH-t nátronlúggal 5,6-ra állítjuk be. Szobahőmérsékleten állandó keverés közben, 6 órán át végezzük a kivonást. A szervmaradékot ezután centrifugálással különítjük el s a fölöttes léből vékony vattarétegen szűrjük ki a zsírnemű szennyezéseket. A 6 liter térfogatú kivonatot —5 C° hőmérsékletre hűtjük és 12 liter ugyanilyen hőmérsékletű etilalkohollal csapjuk ki belőle a tripszint. A deszt. vizes oldás után fagyasztott állapotból szárított nyerstermék súlya Hb 18 g, aktivitása 1,06 [TU]^ .Az ebből savanyú közegben 0,4—0,7 telítési határok közt ammonszulfáttal leválasztott, dializált tripszinkészítmény Hb 2,26 g súlyú, 8,3 [TU] aktivitású volt. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás tripszin kinyerésére insulinmentes hasnyálmriigy 'maradékból, melyre jellemző, hogy az enzim kivonását 25—45 térfogat^százialékos, vízzel keveredő szerves oldószerrel, vízoldható szervetlen, vagy szerves só' jelenlétében pH 4,0—6,8, előnyösen. 5,0—6,5 határok közti közegben végezzük, az így nyert kivonatból a tripszint — 15—0 C° közti hőmérsékleten, előnyösen —5 C°-on a szerves oldószer töiménységének növelésével kicsapjuk, elkülönítjük és adott esetben a kapott nyers enzimet vizes oldatából fagyasztjuk és szárítjuk, illetve tovább tisztítjuk. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a kivonási műveletet 20— 40 C° közti hőmérsékleten végezzük. 3. Az 1. és 2. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a tripszin kivonását vízoldható szervetlen, vagy szerves só, előnyösen puferhatású nátrium-, vagy ammóniumacetát literenként, célszerűen 0,15—1,0 mól menynyiségének jelenlétében végezzük.