146687. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamin tartalmú fermentátum előállítására Rhizobium melilotti törzs variánsával
u Megjelent: 1960. május 15. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 146.687. SZÁM 12. p. 11-17. OSZTÁLY •— 10—86. ALAPSZÁM Eljárás Bi2 vitamin tartalmú fermentátum előállítására Rhizobium melilotti törzs variánsával Dr. Johan Béla orvos, Budapest, dr. László Pálné vegyész, Budapest A bejelentés napja: 1958. augusztus 29. Ismeretes, hogy Rhizobium •meliloti törzs fermentálás során BJ2 vitamint termel. A Bi2 vitamin koncentrációja azonban kicsi, .irodalmi adatok szerint milliliterenként általában 1 gamma körül mozog. Kísérleteink során úgy találtuk, hogy a Rhizobium meliloti törzsnek (az „S" csoporton belül is több) variánsa van, melyekkel lényegesen nagyobb B12 vitamin koncentrációt érhetünk el, ugyanakkor vastűrőek és olcsó nitrogénforrást használhatunk a fermentáláshoz. Kísérleteink során az alábbi „A", „B" és ,,C"vel jelölt variánsokat sikerült elkülöníteni: Az „A" variáns telepei laposak és nagyok és csak kevés nyákot termelnek. A ,,B" variáns telepei valamivel kisebbek mint az „A" variánsé és nyák termelésük szintén kicsi. AB12 vitamin termelése az „A" és „B" típusnak közel egyformán nagy, de általában a ,,B" variánsé valamivel gyengébb. A ,,C" variáns telepei az előbbieknél nagyobbak, domborabbak, áttetszőbbek, és erősen' nyákosak. A ,,C" variáns B12 vitamin termelése lényegesen kisebb, mint az „A" vagy ,,B" variánsé, úgy, hogy a fermentálásnál a ,,C" variánst ki kell küszöbölni. A fenti meghatározás alapján az „A" esetleg a ,,B" variánsokhoz, a törzsszelekeióná] szokásos módszerek segélyével, szélesztéssel és a megfelelő telepek kiválasztásával és szaporításával juthatunk. A találmány értelmében tehát a fermentáláshoz Rhizobium meliloti törzs előzetes szelekció alapján kiválasztott és szaporított, viszonylag kis nyákkápzésű variánsát használjuk. A Rhizobium törzsből célszerűen az „A" variánst választjuk ki, de hasonló eredményeket érhetünk el a ,,B" variánssal is. E variánsok telepei laposabbak, kisebbek és kevésbé áttetszők mint a ,,C" variáns telepei. A fermentáláshoz átszimilálható szénhidrátot, asszimilálható nitrogénforrást és szervetlen sókat tartalmazó táptalajt [használunk. Ügy találtuk, hogy adott f ermentálási feltételek mellett a B12 vitamin hozamot a szénhidrát C és a nirogénforrás N arányának beállításával optimális értékre hozhatjuk. Ezt az optimális N/C arányt néhány előkísérlettel könnyen megállapíthatjuk, előnyösen a szerves nitrogén vegyületek N értéke a táptalajban 0,1 és 0,4 g/%," a szénhidrát mennyisége pedig 1,0 és 3,5% között változhat. A fermentálást aerob feltételek mellett végezzük és úgy találtuk, hogy a legjobb eredmények eléréséhez a szokásosan alkalmazottnál kisebb menynyiségű levegőt kell használnunk. így 0,5 liternél kevesebb, előnyösen 0,1—0,3 liternyi mennyiségű levegőt vezetünk át a fermentátum minden literjére számítva percenként. Igen jó eredmény érhető el, ha nitrogént orrásként az olcsó kukoricalekvárt használjuk. Ügy találtuk, hogy a B12 vitamin termelését általában bizonyos mértékben növelhetjük, ha a szénhidrátforrásként alkalmazott cukrot a táptalajban oldva sterilezzük. A sterilezés optimális időtartamát a használandó táptalaj összetételhez célszerűen rázott tenyészetekkel végzett előkísérletekkel határozzuk meg. Szénhidrátforrásként előnyösen az olcsó krumplicukrot használjuk. A fermentálást vaskészülékben végezhetjük, mert a szóbanlevő törzs és annak kedvező variánsai nem vasérzékenyek. A fermentálás időtartama 26 és 27 C fok közötti hőmérsékleten 45 óránál rövidebb, előnyösen 32— 34 óra. A találmány szerinti eljárás kivitelére az alábbi példákat adjuk meg: 1. példa. A fermentáláshoz Rhizobium meliloti törzs „A" variánsot használjuk. A táptalaj összetétele a következő: Táptalaj : K2 H PO4 0,6 g CoCl2 6H 2 0 0,012 g KH2 P0 4 0,5 3, Burgonyacukor 30,0 g MgS04 7H 2 0 0,5 g Pékélesztő kiv. sz. a. 4,0 g KCl 0,2 g Kazein hidrolizátum FeS04 7H 2 0 0,02 g sz. a. 15,0 g Víz 1 literre kiegészítve pH=7,8 sterilezés előtt.
