146631. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cisztin-tartalmú polipeptidek előállítására

O Megjelent: 1960. április 30. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁí 146.631. SZÁM 12. p. 11—17. OSZTÁLY — Rí—189. ALAPSZÁM SZOLGALATI TALÁLMÁNY Eljárás ciszíin-tartalmú polipeptidek előállítására Richter Gedeon Vegyészeti Gyár Rt., Budapest Feltalálók: Bajusz Sándor, a Gyógyszeripari Kutató Intézet tudományos munkatársa, Kisfaludy Lajos vállalati kutató vegyész, mindketten budapesti lakosok A bejelentés napja: 1958. június 30. Az agyalapi mirigy egyik hormonjának, az Oxitocin szerkezetének felderítése után (V. du Vigneaud és tsai, JACS 75. 4880 [1953] és H. Tuppi, Bioehem. Biophys. Acta 11. 449 [1953]) csakhamar napvilágot látott a teljes szintézisről szóló közlemény is (V. du Vigneaud és tsai, JACS 76. 3115 [1954]), melynek módosításáról rövidesen három kutatócsoport számol be (R. A. Boissonnas és tsai, Helv. Chim. Acta, 38. 1491 [1955], J. Ridinger és tsai, Collection 21. 202 [1956], ill. L. Velluz és tsai, Bull. Soc. Chim. France, 1956, 1464). A későbbiek során néhány íxitoein analógot, illetőleg az agyalapi mirigy másik hormonját, a vazopresszint is sikerült előállítani szintetikus úton (P. G. Katsoyannis és tsai, JACS 79. 4615 [1957]). . Mindegyik eljárás megegyezik abban, hogy a védőcsoportoktól megszabadított nonapeptidamidlánc szabad szulfhidril csoportjainak oxidációját adott pH mellett a levegő oxigénjével végzi a kívánt diszulfid kötés kialakítása céljából. A találmány — a biológiai aktivitás szempontjából döntő fontosságú — utolsó lépés kiviteli módjára vonatkozik. Vizsgálataink során arra a meglepő eredményre jutottunk, hogy az oxidációt igen előnyösen befolyásolja oxidáló ágens, pl. peroxid jelenléte. Ugyanazon nonapeptidből kiindulva, a védőcsoportok ismert módon való eltávolítása után a kísérleti oldatok azon része, melyet hidrogénperoxiddal kezeltünk, illetőleg peroxid jelenlétében levegőztettünk, 60—100%-kal magasabb aktivitást mutatnak, mint a V. du Vigneaud által leírt módszer szerint kivitelezett oxidációval előállítottak. Az oxidáló ágens mennyisége előnyösen 0,5—3 ekvivalens védett nonapeptidamidra szániítva, de kisebb, mint 10 ekvivalens. Az oxidációt szobahőmérsékleten végezzük 6—7 közötti pH tartományban. Az eljárás szemléltetésére az alábbiakban néhány kísérleti példát közlünk : 1. példa: 100,6 mg védett nonapeptidamidót 30 ml vízmentes, desztillált, folyékony ammóniában oldunk, majd állandó keverés közben kapillárisból addig adagolunk hozzá fémnátriumot, míg maradandó világoskék szín nein keletkezik. 19,2 mg arnmóniumklorid hozzáadásával az oldatot elszíntelenítjük és liofihzáljuk. A maradék fehér port 500 ml kiforralt bideszt. vízben oldjuk, az oldat pH-ját 6,5-re állítjuk és négy részre oisztjuk. Az első részhez (A) egy ekvivalens, a második részhez :(B) 0,5 ekvivalens, a harmadik részhez (C) 2 ekvivalens 0,1%-os vizes hidrogénperoxid oldatot adunk, majd két órán át levegőztetjük, a negyedik részt (D) oxidáló ágens hozzátétele nélkül csak levegőztetéssel oxidáljuk. „A" oldat biológiai aktivitása 98 NE/mg védett nonapeptid amid, a „B" oldaté 82 NE/mg, a „C" oldaté 89 NE/mg és a „D" oldaté 47 NE/mg, a Ph. Hg. V. szerint leírt módszerrel vizsgálva. 2. példa: 100,2 mg védett nonapeptid-amidból az 1. példában leírt módon állítjuk elő a szabad nonapeptidamidót. 500 ml kiforralt bideszt. vízben oldjuk és az oldatot három részre osztjuk. Az első részhez (A) 1 ekvivalens, a 'második részhez (B) 10 ekvivalens 0,1%-os vizes hidrogénperoxidot adunk, levegőztetjük, míg a harmadik részt (C) csak levegőztetéssel oxidáljuk. Az ,,A" oldat biológiai aktivitása 95 NE/mg védett nonapeptidamid, a „B" oldaté 46 NE/mg és a „C" oldaté 59 NE/mg a fenti módszerrel mérve. 3. példa:. 500,9 mg védett nonapeptidamidból az 1. példában leírt módszer szerint állítjuk elő a szabad nonapeptidamidót, ezt 500 ml kiforralt bideszt. víziben oldjuk és az oldatot két részre osztjuk. Az