146495. lajstromszámú szabadalom • Eljárás antibiotikum előállítására
4 146.495 0,25 g KCl-ot és 0,25 g MgS04 és 400 ml vizet adtunk. Az így kapott táptalaj pH-értékét 7-re állítottuk be. Az oldatot sterilizáltuk, majd 25 ml külön sterilizált 40%-os glükozoldatot adtunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a táptalaj glükóztartalma 2% legyen, imajd térfogatát steril vízzel 500 ml-re töltöttük fel. A kész táptalajt kaccsal beoltottuk a szilárd táptalajon nevelt törzzsel, majd rázóasztalon 27 C° hőmérsékleten tartottuk. 80 órás rázatás után a tenyészet továbiboltásra alkalmassá vált. b) Inokulum készítése 4 liter kútvízhez 40 g peptont, 160 g glicerint, 2 g MgSO4 -0t, 7H 2 0-t, 20 g Na 2 HP0 4 -ot és 2 g KH2 P0 4 -t adtunk. Kb. 4,5 liter folyékony táptalajt kaptunk, melynek pH-értékét 7,2-re állítottuk be. Ezt a táptalajt sterilizáltuk, majd beoltottuk a kb. 500 ml előinokulummal és 25 C° hőmérsékleten rázóasztalon rázattuk 36 óra hosszat. 36 óra elteltével a lé színe fakósárga lett és nagy tömegű micéliumot tartalmazott, pH értéke nem változott. c) A fermentálás lefolytatása 6 db egyenként 12 liter hasznos térfogatú üvegfermentoríban az alábbi összetételű sterilizált táptalajt töltöttük: Burgonyacukor (100%-os) 2,00% Pepton 0,25% MgS04 • 7H2 0 0,05% Na2 HP0 4 0,50% KH2 P0 4 0,05% pH sterilizálás után 7-re állítottuk be. A fenti módon előállított inokulumot 6 egyenlő részre osztva beoltottuk az egyes fermentorokba. A fermentációt percenként 240 fordulatszámú keveréssel 27 C° hőmérsékleten folytattuk le; beadagolt levegőmennyiség 1 liter táptalajra 0,5 liter volt percenként. A habzás meggátlására a fermentáció elején 20—20 ml napraforgóolajat adtunk mindegyik fermentorba, majd a fermentáció vége felé részletekben további 20—20 ml-t. A fermentációs lé színe 48 óra múlva már élénk sárga volt és a lé erősen besűrűsödött. A hatóanyag mennyiségének meghatározása céljából a 36., 60. és 84. órában vett minták 0,55 g/liter, 1,25 g/liter, ill. 1,55 g/liter tiszta hatóanyagtartalmat mutattak. A fermentáció közben 12 óránként végzett sterilitási vizsgálat azt mutatta, hogy a fermentáció mindvégig sterilen folyt le. A táptalaj cukortartalma a 84. órára már 0,2%-ra csökkent, ezután a fermentáció továbbfolytatása már nem volt indokolt. d) A fermentációs lé feldolgozása 70 liter micéliumos fermentációs levet megszűrtünk, a szűrőn 4 kg szűrőnedves, zöldessárga színű szilárd anyag maradt vissza. Ezt visszafolyató hűtő alatt V2 óra hosszat forraltuk 4 liter etilacetáttal, majd az etilacetátot a micéliumról leszűrve, a forralás újabb 4—4 liter etilacetáttal még 5 ízben megismételtük. Az egyesített szűredéket vákuumban 40—50 C°-on zavarodásig bepároltuk; kb. 5 liter koncentrált oldatot kaptunk. Ezt szolbahőmérsékletre lehűtve a hatóanyag kristályosan kivált. Leszűrtük, majd hideg acetonnal és hideg éterrel mostuk és vákuumban megszárítottuk. 104 g sárga kristályos terméket kaptunk. Az anyalúg további besűrítése útján még további 6 g hasonló tisztaságú anyag volt nyerhető. 2. példa: ^ 40 liter fermentációs levet, amelyet az 1. példa a)—c) pontjaiban leírt módon, csupán azzal az eltéréssel állítottunk elő, hogy a habzás gátlására nagyobb mennyiségű napraforgóolajat adtunk a fermentáció során a léhez, leszűrtünk. A fermentációs levet (micélium nélkül) és a hafozásgátló olajat tartalmazó szűredékhez 5 térf. %, kloroformot adtunk és összekevertük. A fázisok elkülönítése után a flavofungin a kloroformos fázis határán kivált. Ezt a fázist elkülönítettük és poharas centrifugán centrifugáltuk. A eentrifugálással szilárd flavofunginról a kloroform maradékait vákuumban elűztük, a száraz maradékot 400 ml acetonnal eldörzsöltük. Az acetonban melegen feloldódott flavofungin lehűlésekor kristályosan kivált. Leszűrtük, hideg acetonnal mostuk, majd 5 liter forró etilacetátból átkristályasítottuk. 38 g tiszta kristályos flavofungint kaptunk. A kiszűrt micéliumot, amelynek súlya szűrőnedves állapotban kb. 2,5 kg volt, 10x2 liter hideg metanollal kevertük, minden alkalommal leszűrve. Az egyesített szűredéket kb. 5 literre bepárolva a flavofungin nyers állapotban kivált. Forró etilacetátból átkristályosítva 16 g tiszta flavofungint kaptunk. A metanolos anyalúgot a még benne levő flavofungin kinyerése végett még tovább kb. 2 literre besűrítettük, 300 ml vizet adtunk hozzá, majd az elegyet 200' ml térfogatra bepároltuk. Lehűlés után 1 liter butanollal extraháltuk, a butanolos kivonatot szirupsűrűségig (kb. 200 ml) bepároltuk. Hozzáadtunk 800 ml etilacetátot, mire a kísérő szennyezések kicsapódtak: A csapadékot eentrifugálással elkülönítettük, majd az etilacetátos szűredéket újból szirupsűrűségig pároltuk be és 600 ml petroléfcert adtunk hozzá. A nyers flavofungin nem kristályos alakban kicsapódott, ezt acetonból, majd forró etilacetátból átkristályosítva újabb 16 g tiszta flavofungint kaptunk. Az összes flavofungin-hozam tehát 38 -\- 16 + + 16 = 70 g volt. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás gomba ellenes hatású antibiotikum kinyerésére az SA—IX. és/vagy SA—IX—3. törzsek tenyésztésével, azzal jellemezve, hogy a törzseket szénhidrátot és fehérje hidrolizátumot, továbbá ásványi sókat tartalmazó, célszerűen 7 pH kémhatású táptalajban fermentáljuk 25—29 C° hőmérséklet mellett levegőztetett kultúrában, majd a képződött hatóanyagot szerves oldószerrel elkülönítjük. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a hatóanyagot szer-
