146263. lajstromszámú szabadalom • Eljárás az I-szpiramicin biokémiai átalakítására II- és III-szpiramicinné
amely 13% Il-szpiramicint és 87% III-szpiramicint tartalmaz. 12. példa: Két 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50—50 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumklorid 19 g Glükóz 50 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. Az Erlenmeyer-lombikokba letöltött táptalaj sterilizálása, beoltása és a kultúrák inkubáltatása a 2. példában leírt módon történik. A lombikok tartalmát 72 órai inkubáltatás után centrifugáljuk, és a szupernatans folyadékot eltávolítjuk. A centrifugált üledék egyik felét egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikban 50 ml olyan vizes oldatban szuszpendáljuk, amely 6 g/liter tiszta I-szpiramicin-bázist, 2,3 g/liter propionsavat és 1 g/liter kobaltklorid-hexahidrátot tartalmaz, és amelynek pH-értékét nátriumhidroxid-oldattal 6,5-re állítottuk be. A centrifugált üledék másik felét 50 ml ugyanilyen összetételű, de még 10 g/liter glükózt is tartalmazó oldatban szuszpendáljuk. A micélium-szuszpenziót tartalmazó Erlenmeyerlombikokat 2 napig inkubáltatjuk rázóasztalon 25 C° hőmérsékleten. Ezután mindkét lombik tartalmát külön-külön megelemezzük papírkromatográfiai módszerrel. Az elemzési eredményeket az alábbi táblázat mutatja: Az átalakult A kérféle szpiramicin I-szpiramicin aránya %-ban mennyisége g/Hter II , III Glükóz nélkül 2,22 14 86 Glükózzal 3,70 14 86 13. példa: Egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikba 50 ml-t töltünk az alábbi összetételű táptalajból: Ammóniumklorid 10 g Glükóz 50 g Kalciumkarbonát 25 g Vízvezetéki vízzel feltöltve 1000 ml-re. A lombik tartalmának sterilizálása, beoltása és a kultúra inkubáltatása 2. példában leírt módon történik. 72 óra inkubáltatás után a lombik tartalmát centrifugáljuk és a szupernatans folyadékot eltávolítjuk. A centrifugálási üledéket egy 300 ml-es Erlenmeyer-lombikban 50 ml pufferoldatban szuszpendáljuk. Az e célra alkalmazott pufferoldat 9,85 g/liter jégecetet és 4,9 g/liter nátriumacetátot tartalmaz, pH-értéke 4. Ehhez a pufferoldathoz még 6,45 g/liter tiszta I-szpiramicin-hidrokloridot és 1 g/liter kobaltklorid-hexahidrátot adunk. A szuszpenziót tartalmazó Erlenmeyer-lombikot 80 óra hosszat inkubáltatjuk rázóasztalon, 25 C° hőmérsékleten. Ezután a lombik tartalmát papírkromatográfiai úton elemezzük; azt találjuk, hogy 2,40 g/liter I-szpiramicin alakult át oly eleggyé, amely 90% Il-szpiramicint és 10%. III-szpiramicint tartalmaz. 146.263 14. példa: Egy 170 literes fermentorba az alábbi anyagoka adagoljuk be egymás után: Kukoricalekvár (50%-os száraz kivonat) 4800 g Keményítő 2400 g Nátriumklorid 600 g Magnéziumszulfát 120 g Monokalciumfoszfát 240 g Vízvezetéki víz 100 liter. A táptalaj pH-értékét 750 ml 400 g/liter koncentrációjú nátriumhidroxid-oldat hozzáadása útján 6,7-re állítjuk be. Azután még a következe anyagokat adjuk ,hozzá: Kalciumkarbonát 600 g Szójaolaj ' 60 ml Szilikon-habzásgátló 60 ml. A fermentort és tartalmát vízgőz 122 C° hőmérsékleten 40 percig történő bevezetése útján sterilizáljuk; ezáltal a fermentor tartalmának térfogata beáll a 120 liter végső térfogatra. Lehűlés után a fermentort 25 C° hőmérsékleten tartjuk és beoltjuk 250 ml inokulum-kultúrával, amelyet az 1. példában leírt módon készítettünk el. A táptalajt ezután 350 percenkénti fordulatszámú csavarszárnyas keverővel keverjük és óránként 5 m3 levegővel szellőztetjük. 23 óra elteltével a S. ambofaciens kultúra bőséges fejlődését tapasztaljuk. Ezután egy másik, 30 literes fermentorban az alábbi összetételű táptalajt készítjük el: Ammóniumklorid 150 g Kristályos glükóz 750 g Vízvezetéki víz 14 liter. A fermentort és tartalmát 40 percig sterilizáljuk vízgőzbevezetéssel, 122 C° hőmérsékleten. Lehűlés után a fermentort 25 C° hőmérsékleten tartjuk, és hozzáadunk 2 liter steril vízben szuszpendált 375 g kalciumkarbonátot; ezzel a táptalaj térfogata 15 literre növekszik. A táptalaj pH-értéke 7,5. Ezután a táptalajt beoltjuk a 170 literes fermentorban a fentebb leírt módon elkészített és 23 óra hosszat inkubáltatott inokulum 1,5 liternyi mennyiségével. A beoltott táptalajt 550 percenkénti fordulatszámú csavarszárnyas keverővel keverjük és óránként 1 m3 levegővel szellőztetjük. 48 órai fermentáció után a S. ambofaciens kultúra jól kifejlődött, a fermentációs lé pH-értéke 6,5. Ekkor az alábbi összetételű vizes oldatot adjuk a fermentor tartalmához: Szpiramicin-bázis 150 g Nátriumpropionát 19 g Kobaltklorid-hexahidrát 17 g Propionsav n-oldata 300 ml Desztillált víz 1000 ml. A fenti oldatban szpiramicin-bázisként nyers szpiramicin-bázist alkalmazunk, amely 65, 23, ill. 12% I-, II-, ill. III-szpiramicint tartalmaz.
