145921. lajstromszámú szabadalom • Eljárás delta 1,4-androsztadiéndionnak fermentációs közegből történő meghatározására az optimális termelési szint időpontjának megállapítására

o Megjelent: 1959. december 31. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 145.921. SZÁM 12. g. OSZTÁLY — GO—545. ALAPSZÁM SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY Eljárás ^14

-androsztadiéndionnak fermentációs közegből történő meghatározására az optimális termelési szint időpontjának megállapítására Gyógyszeripari Kutató Intézet, Budapest Feltalálók: Mizsei Antal, Szabó Antal és dr. Wix György A bejelentés napja: 1956. szeptember 4. Ösztron előállítása ipari méretekben ez ideig lóvizeletből történt. Mivel az ösztron a lóvizeletben igen kis koncentrációban van jelen, ez a módszer hatalmas mennyiségű lóvizelet összegyűjtését tette szükségessé. A nagytömegű lóvizelet összegyűjtése és abból az ösztronnak a számos szennyeződés mellől tisztán való előállítása nagy energia- és munkaköltséggel járó művelet. Ezen állapot megszüntetésére nyújtott alapot Vischer és Wettstein felfedezése (Experientia 9, 371 /1953/), ami szerint progeszteronból jó termeléssel előállítható zl'^-androsztadiéndion (továbbiakban androsztadiéndion), mely utóbbi aromatizációval egy lépésben ösztront szolgáltat. Vischer és társa módszerét azonban — mint ahogy az később kiderült — nem lehetett minden további nélkül jól reprodukálni. A biológiai oxidációs folyamat ugyanis több egymást követő, ill. szimultán reakcióból tevődik össze és a maximális androsztadiéndion koncentráció egy előre nem ismert időpontban áll elő. Japán szerzők pl. Vischer és társa fent leírt termelését megismételni nem tudták. Kísérleteikben a várt androsztadiéndion mellett több, különféle mértékben oxidált anyagot kaptak. Vischer és társa termelési módszerével a folyamat nem volt kézbentartható, mivel a produktum összetételéről csak az oxidációs folyamat lefolytatása után lehetett hosszadalmas papírkromatográfiás eljárás, ill. a feldolgozás eredménye után következtetni. Az androsztadiéndion gazdaságos termelésére eddig nem ismertetett olyan módszert dolgoztunk ki és vezettünk be, melynek segítségével maga a biooxidációs fermentáció folyamata alatt lehet az .androsztadiéndion mennyiségét követni. Ezáltal az androsztadiéndion maximális, ill. a túloxidált anyag minimális kialakulásának időpontja megállapítható és a folyamat leállítása ezen optimálisan kedvező időpontban eszközölhető. A találmány olyan eljárás, melynek segítségével az androsztadiéndion koncentráció szintje a fermentáció folyamán sűrű időközökben, félóránál i'övidebb idő alatt meghatározható. A találmány értelmében az androsztadiéndion meghatározására fermentációs folyadék esetében akként járunk el, hogy a fermentációs folyadékot apoláros oldószerrel kivonatoljuk, a kivonatot bepároljuk, a maradékot az androsztadiéndionnal színes reakcióterméket adó reagenssel elegyedő oldószerben feloldjuk, majd e reagenssel színreakciót létesítünk és á kapott oldat színintenzitását mérve az androsztadiéndion tartalmat e színintenzitás alapján meghatározzuk. Kísérleteink során megállapítottuk, hogy a fenti színreakciót zavaró anyagok poláros jellegűek, melyeket megfelelő apoláros oldószer gyakorlati mértékben nem old. Apoláros oldószerként alifás és aromás szénhidrogének, valamint azok halogénezett és hidráit származékai (pl. hexán, ciklohexan, benzol, toluol, etilenklorid, széntetraklorid) bizonyultak alkalmasnak. Ezek közül is legelőnyösebben a széntetrakloridot alkalmaztuk. Egyéb oldószerek, mint a különféle éterek, észterek, oxi-és karbonil vegyületek viszont már több-kevesebb zavaró anyagot is extraháltak. Módszerünk alkalmas arra, hogy az így kiextrahált szteroid keverékből megfelelő színreakcióval csupán a kívánt terméket, az androsztadiéndiont, egyszerű módon és rövid idő alatt kvantitatíve mérjük. E célból az extraktum megfelelő mennyiségét bepároljuk, majd a száraz-maradékot olyan oldószerben oldjuk fel, amely a későbbiekben tárgyalt reagenssel elegyedik és a reakciót nem befolyásolja kedvezőtlenül. (Erre a célra mint Legalkalmasabbat, etanolt használtunk.) Az így nyert elegyben olyan — az alábbiakban ismertetett módszerrel — szelektív reakciót hajtunk végre, melynek eredményeképpen nyert színes termék fotometriás, ill. kolorimetriás mérésén keresztül magát az androsztadiéndion mennyiségét megkaptuk. Kiválasztott hullámhosszon eszközölt mérés esetében a kiindulási és az androsztadién-