145314. lajstromszámú szabadalom • Eljárás insulin tisztítására
Megjelent: 1959. szeptember 15. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 145.314. SZÁM 30. 1. 1-8. OSZTÁLY — Cl—254. ALAPSZÁM SZOLGÁLATI TALÁLMÁNY Eljárás insulin tisztítására Chinoin Gyógyszer- és Vegyészeti Termékek Gyára, Budapest. Feltalálók: dr. Bagdy Dániel tudományos munkatárs, Gyógyszeripari Kutató Intézet; Martin Sándor vegyész, Chinoin és B. Fogarasi Marianne tudományos s. munkatárs, Gyógyszeripari Kutató Int. A bejelentés napja: 1957. november 16. Az insulin tisztítására vonatkozó legrégibb, de ma is gyakran használt módszerek a kisózásos frakcionálás (Best, C. H., Handfo. d. biol. Arbeitsmethoden. Abt. V, T. 3 B, S. 508. 1927.) és az izoelektrornos kiosapás (Doisy, E. A. és munkatársai J. Biol. Chem. 59, XXXIV. 1924.). Alkalmazzák ezenkívül a pikrinsavas (Sordelli, A., és V. Deulofeu, Séances Soc. Biol. Filiales 89, 743. 1923.) és a tri'klórecetsavas eljárást is (Dickens, F. és mt. Bioohem. J. 21. 560. 1927.). Elméleti és gyakorlati szempontból egyaránt haladást jelentenek az insulin tisztításában a különféle adszorpciós módszerek. Ezek közül az aktív szenes adszorpció (Moloney, P. J. és D. M. Findlay: J. Physical Chem. 28, 402. 1924.) gyakorlati értékét kedvezőtlenül befolyásolja az a tény, hogy az adszorbensen megkötött hormon leoldásahoz nagymennyiségű benzoesavra van szükség, amit azután éteres extrakcióval kell eltávolítani; nem írható előnyére ennék az eljárásnak továbbá az sem, hogy előtisztított hormont igényel. Ismeretes ezenkívül cinkhidroxidos adszorpciós módszer (Tetsuo Shibata: Hukuoka Acta Med. 43, 278. 1952.), valamint ioncserés adszorpciós eljárások is (Szarnszonos és Fagyejeva: Biokhimija, 21,403.1956.). Bár az insulin Ikarboxyl- és szulfonsav-típusú ioncserélő műgyantán egyaránt megköthető, a módszer ipari alkalmazhatóságát kérdésessé teszi az a tény, hogy az eluálás csak nagy térfogatú oldószerrel és erősen lúgos pH értékeknél valósítható meg, ami mind az üzemi gyártás technológiája, mind pedig a termelt insulin minősége szempontjából kedvezőtlen. Diklór-diimetil-szilánnal előkezelt .Hyflo-Supercel-en történő megoszlásos kromatográfiás eljárást ismertetett az insulin tisztítására R. R. Porter (Biochern. J. 53, 320. 1953., és Angol szabadalom 735.517). Bár kétségtelen, hogy ez a módszer hatásosságában valamennyi korábbit felülmúlja, gyakorlati értékelésében nem hagyható figyelmen kívül az, hogy az adszorbens oszlopon átfolyt, tiszta insulint tartalmazó oldathói a bormon nem csapható ki közvetlenül, s fagyasztott állapotban történő szárítása előtt hosszadalmas dialízisnek kell alávetni, az oldatot a megoszlásos kromatográfiához használt jelentékeny mennyiségű szervetlen só eltávolítása céljából. Saját kutatásaink során azt találtuk, hogy a különböző eredetű hasnyálmirigyekből különféle kivonási eljárásokkal kivont insulin, vizes, vagy vízzel elegyedő oldószert kis mennyiségben tartalmazó vizes oldatából jól adszorbeálódik bizonyos szilikát típusú adszorbensekre; az adszorbensen megkötött hormon vízzel elegyedő szerves oldószerrel könnyen leoldható s a szerves oldószer lepárlása után az adszorpciós úton tiszttított insulin vizes oldatából közvetlenül kristályosítható. Találmányunk lényege az a felismerés, hogy az insulin szilikát típusú adszorbenseken savas közegben szelektíve megkötődik, ugyanakkor a kísérő szennyező anyagok, amelyek a hormon kristályosítását gátolják, nem, vagy csak igen csekély mértékben és laza kötésben, s így az adszorbensről könnyen lemoshatok. A gyengén alkalikus közegben végzett eluoió így egy lépésben olyan tisztaságú insulint szolgáltat, amely közvetlenül kristályosítható. Találmányunk tehát olyan könnyen kivitelezhető egyszerű adszorpciós módszert jelent, amely egymagában, minden más eddig ismertetett tisztítási művelettel való kombináció nélkül is megfelelő hatásfokú s így alkalmas kristályos insulin közvetlen előállítására. , A találmány értelmében vizes, vagy vízzel elegyedő szerves oldószert kis mennyiségben tartalmazó vizes insulin kivonatot aképpen tisztítunk, hogy szilikát típusú adszorbenssel savanyú közegben összehozva az insuünt adszorbeáltatjuk, majd az adszorbensről az insulint vízzel elegyedő oldószert tartalmazó, lúgos kémhatású vizes- oldattal eluáljuk. Ha a tisztítandó insulin kivonat pl.
