145287. lajstromszámú szabadalom • Eljárás plazma-, illetve szérumfehérjék frakcionálására és tisztítására

Megjelent: 1959. szeptember 15. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 145.287. SZÁM 30. k. 1-8. OSZTÁLY — TO—413. ALAPSZÁM Eljárás plazma-, illetve szérumfehérjék frakcionálására és tisztítására Humán Oltóanyagtermelő és Kutató Intézet, Budapest Feltalálók: dr. Richter Péter vegyész, Tóth István gyógyszerész A bejelentés napja: 1956. augusztus 9. A plazma-, illetve szérumfehérjék frakcionálásra szolgáló eljárások közül a legprecízebb szétválasztást teszi lehetővé az organikus oldószerekkel történő frakcionálás. A fehérjék kicsapódását több tényező — organikus oldószer koncentráció, pH, hőmérséklet, sókoncentráció és fehérje koncentráció — befolyásolja és ezek variálása számos eljárás kidolgozását teszi lehetővé. Eljárásunk röviden a következő: Plazma vagy szérum hígítatlanul és hígítva is feldolgozásra kerülhet. Az anyag 0—1 C°-ra hűtendő, majd 9%-ig —10, —15 C°-os alkoholt adva hozzá, a fibrinogént isoelektromos pontján kicsapjuk. A második kicsapás —3, —5 C°-nál, 20—22 százalékos alkohol koncentráció mellett, a gammaglobulin isoelektromos pontján, az első csapadék felülúszó folyadékából történik. Az így kapott csapadékból pH 5—5,2 között 15%-os alkohollal kioldjuk a gamma-globulint és az oldatból kicsapjuk 20—22%-os alkohol koncentráció mellett, pH 7—7,2-nél. A csapadékot liofilizáljuk. Az első csapadék felülúszó folyadékából az albumint az oldat pH-jának 4,8-ra történő beállításával kapjuk, —5, —7 C°-on. A csapadékot kb. 1 :1,3 arányban hozzáadott 5%-os alkohollal —2, —4 C°-nál kioldjuk, majd az oldatot fele térfogat vízzel hígítva liofilizáljuk. Az egyes frakciók leválasztását mindenegyes alkalommal isoelektromos ponton végeztük. Megállapítottuk, hogy az egyes frakciók leválasztását az ionkoncentráció változás csak korlátozott mértékben befolyásolja. Az egyes frakciók jó elkülönítése és tökéletes kiválása az eljárásban közölt pH feltételek megteremtéséhez szükséges ionkoncentráció változások során magától biztosított. A pH-t minden alkalommal hígítás nélkül 25 C°-nál, az alkohol térfogatát pedig —15 C°-nál mérjük. Az előállítás során kapott termékek tisztaságát Boskamp Antweiler electrophoretizáló készülékkel vizsgáltuk. A gamma-globulint összehasonlítottuk az eljárásunkhoz hasonló egyszerűségű Nitschmann-féle eljárás megfelelő frakcióival. A Nitschmann-eljárás szerint általunk előállított gammaglobulin vizsgálati eredménye megegyezett a külföldi adatokkal és 10%-ig terjedő alfa-globulin szennyezést tartalmazott. A Deutsch-féle eljárással készült anyag is hasonló szennyezést tartalmaz. A bejelentett eljárásunk szerint készített gammaglobulin 35% albuminszennyezésnél több szennyezést nem tartalmaz. Eljárásunk nagy előnye, hogy a kitermelés jóval meghaladja az irodalomban megadott kitermeléseket. Az egyes eljárásokkal kapott termékek jellemző adatai Cohn 6 és 9 Cohn 6 és Deutsch Cohn 10 .„ , . . módosított '0 modosi(carbamid) t°TM , Nitschraann Deutsch Humán módosítás Plazma proteinre számított gamma-globulin kitermelés %-ban Electrophoretikus tisztaság A-táblázatból látható, hogy az eddigi eljárásokkal összehasonlítva eredményeinket, azoknál 20— 30%-kal jobb kitermelést kapunk és olyan tisztasági fokot érünk el, mint a sokkal komplikáltabb Cohn-féle methodika ad. Az albumin termelésre megadott eljárásunk egyszerűsége az alkohol koncentráció megtartásában és csupán a pH változtatással történő frakcionálásban rejlik. 5—6 6—7 6—7 7—8 9—11 90—99 90—99 90—98 90—99 95—99 1. példa 10 liter citrát plazma vagy szérum hígítva 10 liter friss, pyrogénmentes, ionmentes vízzel. A pH-ját 2n ecetsavval 5,6—5,8-ra állítjuk. Lehűtiük 0—1 C°-ra és hűtés közben hozzácsepegtetünk —15 C°-ra lehűtött 96%-os ethanolt, 9%-os koncentrációig (103,4 ml/liter). Végső hőmérséklet —3 C°. Ezután 3000 ford./perc szögcentrifugán