145171. lajstromszámú szabadalom • Eljárás magas koncentrációjú cianokobalamin és egyéb kobalamin vegyületek oldatának tisztítására
2 145.171 hatóanyag az ammonias mosással teljes egészében oldatba vihető. A találmány szerinti eljárás előnyösen felhasználható a B12 vitamin származékok (etiokobalaminok), ill. rokonvegyületek üzemi méretben való tisztítására is, amikor a kromatográfiás elválasztás a nagy térfogatok miatt előnytelen. így a „B12 vitamin III. faktor" néven ismert neutrális kobalamin származék izolálásánál is. Alkalmas továbbá a kristályosítás után visszamaradó acetonos anyalúgok bepárlásának közvetlen tisztítására is. Ezt a sűrítményt általában a gyártás valamelyik előző fázisához szokták hozzátenni, viszont így közvetlenül feldolgozható. Az alábbi példák a találmány részleteinek szemléltetésére szolgálnak. A felhasználandó reagensek mennyisége természetesen esetenként a kísérő anyagok koncentrációjától függ. 1. példa Metániszapból kipreparált 500 ml cianid és halogénmentes, 0,043 g/ml szárazanyagtartalmú B12 vitamin koncén trátumban — mely dicián módosulattá alakított mintája szerint Dubospue koloriméterrel standardhoz viszonyítva, összesen 4,2 g B12 vitaminnak megfelelő látszólagos értéket mutat (etiokobalaminokkal együtt) — 2,5 g nátriumacetátot feloldunk, majd pH-ját jégecettel 4,3-ra (+ 0,2) állítjuk. Ezután vékony sugárban — állandó keverés közben -— addig csurgatunk hozzá 10%-os vizes AgN03 oldatot fjeién esetben kb. 120 ml-t) míg csapadék kiválást észlelünk. Kis részlet próbacentrifugálásával nyert szupernatanssal meggyőződünk arról, hggy további reagens hozzáadására csapadék már nem képződik. A csapadékos oldatot centrifugáljuk, a leválasztott üledéket pedig többször kimossuk 0,5% nátriumacetátot és 1% AgN03 -ot tartalmazó pH 4,3-as ecetsavas vízzel mindaddig, míg a mosófolyadék piros színeződést mutat. A csapadék mosását pH 8—10-re állított ammóniás vízzel is végezhetjük. A centrifugált mosóvizeket egyesítve a főfrakcióval, 10%-os alkálicianidot adunk hozzá, amíg a kezdetben kiváló csapadék feloldódik, majd pH-ját 30%-os nátriumhidroxiddal 6-ra állítjuk. A további feldolgozást bármelyik ismert módon pl. szenes adszorpcióval vagy a 143.549 számú magyar szabadalmunk szerint végezhetjük el. Kitermelés 2,5 g tiszta B12 vitamin kristály. 2. példa Metániszap feldolgozása folyamán nyert 500 ml B12 vitamin III. faktor tartalmú sűrítmény cianid és halogénmentesített oldatához, mely 0,0523 g/ml szárazanyagban kolorimetriás összehasonlítással összesen 5,9 g kristályos anyagra vonatkoztatott látszólagos értéket mutatott, az 1. példában isníertetett módon 2,5 g nátriumacetátot adunk, majd jégecettel pH 4,3-ra (+ 0,2) állítjuk. Ezután vékony sugárban mindaddig csurgatunk hozzá — állandó keverés mellett — 10%-os AgN03 oldatot, jelen esetben 145 ml-t, míg további reagens hozzáadására csapadék már nem képződik. A kiadásért felel: a Közgazdasá A centrifugálás után nyert csapadékot több ízben 0,5% nátriumacetátot, 1% ezüstnitrátot tartalmazó, pH 4,3-as ecetsavas vízzel kimossuk. A centrifugán kapott oldatokat egyesítjük és 10%-os alkálicianidot adunk hozzá mindaddig, míg a képződött csapadék feloldódik. pH-ját 30%-os NaOH-dal 6-ra állítjuk. Több részletben 1 :2 tf arányú fenol-kloroformmal kirázzuk, majd a fenol-klorof ormos oldatban a kloroformarányt 1 : 4-re állítjuk. A szerves oldószer-<elegyet, térfogatára számított 30%-hyi bikarbonátos vízzel (2% NaHC03 és 0,5% nátriumtioszulfát tartalommal), majd ezt követőleg azonos térfogatú deszt. vízzel kirázzuk. Ezeket sorjában több ízben 1 : 4 tf arányú fenol-kloroformmal visszarázzuk akként, hogy a lúgos mosófolyadék kirázására használt oldószereleggyel folytatjuk a vizes mosófolyadék kirázását. A szerves oldószereket egyesítve, a továbbiakban az ismert, módok valamelyike szerint járunk el. Kitermelés: 3,9 g B12 vitamin III. faktor, kristály. 3. példa 500 ml streptomycin fermentációból származó, cianid és halogénmentes B12 vitamin sűrítményben, — mely 1,84 g B12 vitamint tartalmaz 21 g szárazanyagban, mikrobiológiailag E. coli mutans törzzsel, vagy kolorimetriásan mérve — 2,5 g nátriumacetátot oldunk. pH-ját jégecettel 4,3-ra (i 0,2) állítjuk. Állandó keverés közben addig öntünk hozzá vékony sugárban 10%-os ezüstnitrát oldatot, míg csapadékképződést észlelünk. A centrifugálásBal nyert csapadékot több ízben 1% AgN03-t, 0,5% nátriumacetátot tartalmazó, jégecettel pH 4,3 (+ 0,2)-ra savanyított vízzel kimossuk, míg a mosófolyadék piros színű. Az egyesített szupernatansokhoz 10%-os alkálicianidot öntünk, míg a kivált csapadék feloldódik. 30%-os nátriumhidroxiddal 6-ra állítjuk az oldat pH-ját, majd a hatóanyagot aktív szénen ismert módon adszorbeáltatva kristályos termékig feldolgozzuk. Kitermelés: 1,7 g B12 vitamin kristály. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás magas koncentrációjú cianokobalamin és egyéb kobalamin vegyületek cianid és halogénmentesített oldatainak tisztítására, azzal jellemezve, hogy a kísérő szennyeződéseket ezüstéionnal leválasztjuk, miközben a kobalamin és kobalaminszerű vegyületek továbbra is oldatban maradnak. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy a leválasztást 6,5—3,5 pH tartományban végezzük. 3. A 2. alatti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a pH-értéket nátriumacetáttal pufferolva, ecetsavval pH 4,3-ra (+ 0,2) állítjuk. 4. 1—3. igénypontok bármelyike szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy a szenynyezések lacsapása után az oldatban levő ezüstionokat vízoldható komplexvegyületté alakítjuk és az oldatból a kobalaminokat izoláljuk. és Jogi Könyvkiadó igazgatója 2401 Terv Nyomda, 1959. - Felelős vezető: Gajda László
