144928. lajstromszámú szabadalom • Eljárás adrenokortikotrop hormon tisztítására

2 144.928 csekély normonveszteség mellett, jó tisztítást eredményeztek. A nyers hormonnál jó hozammal 4—5-ször tisztább készítményeket nyerünk, ha a találmány értelmében a nyers hormon valamely szerves savval, előnyösen ecetsavval megsavanyított vizes oldatát 50° C-nál magasabb hőmérsékletre felhevítjük, a felhevítés előtt, vagy azzal egyidejűleg abban 2—6%, előnyösen mintegy 3% NaCl-t oldunk, a legalább 30° C-ra lehűtött oldatbál kicsapódó ballasztanyagokat eltávolítjuk, majd az oldatban maradó hormont NaCl-al való telítés segélyével kicsapjuk, és a csapadékot az oldattól elkülönítjük. A kiindulási nyers hormont, ha az száraz szervből készült, célszerű előzőleg tömény, célszerűen 90%-C"s

ecetsavban melegen, előnyösen mintegy 80° C-on oldani, majd dietiléterrel kicsapni. Az így kezelt nyers hormont hasonlóan jó eredménnyel tisztíthatjuk, mint a friss szervből kinyert nyers hormont. A találmány szerinti eljárás valamennyi jellemzője elengedhetetlen ahhoz, hogy a kívánt célt elérjük. így például hiába végezzük el a kisózásos frakcionálást ecetsavas oldatban, pl. szobahőmérsékleten, a frakcionálás éppen olyan rosszul sikerül, mintha ásványi savval savanyított oldatban dolgoznánk. Úgyszintén nagy hormoinveszteséget szenvedünk, ha melegen, de ásványi savakkal savanyított közegben (pH 1 és pH 4 között) végezzük a frakcionált kisózást. Feltételezésünk szerint a hormon és a ballasztproteinek között laza, molekuláris kötés áll fenn a nyers készítményben, amely az ecetsavas, hevített oldatban megbomlik, a hormon aktív pontjain ecetsav molekulák kötődnek meg. A részlegesen denaturálódoitt ballaszt-proteinek az oldat lehűlése közben azután anorganikus sók hatására kiválnak az oldatból anélkül, hogy az organikus savval asszociált hormont magukkal ragadnák. A találmány szerint előnyösen úgy járunk el, hogy a nyers hormon hideg híg ecetsavas oldatában 2—6% NaGl-t oldunk és az oldatot néhány percén át forró vízfürdőn hevítjük. A hideg hormonoldathoz adagolt só hatására a fehérje-karakterű anyagok egy része kicsapódik, de hevítés közben ezek is feldidódnak, majd hevítés után, a célszerűen kihűlésig kevert oldatból ismét kicsapódnak. Ezáltal a kicsapódás tökéletesebb. A nyers hormon 30—50%-át kitevő, leválasztott ballaszt biológiai titrálásánál teljesen hatástalannak bizonyult, ellentétben bármely eddig ismert kisózásos eljárásnál nyert ACTH-frafecióval. Az oldatban maradó ACTH-t különböző módszerekkel különíthetjük el. Pl.: Az oldatban levő szervetlen sókat dialízissel eltávolítjuk, majd az oldatot liofilizáljuk. A hormont átrázhatjuk egy alkalmas szerves oldószerbe, pl. fenolba, majd abból éteres, vagy acetonös kicsapással nyerjük. Előnyösen úgy járunk el, hogy a vizes, tisztított hormon-oldatot NaCl-al telítjük, amikor a hormon az oldatból kiválik és pl. centrif ugálással elkülöníthető. A kiszárított hormon ilyenkor NaCl-t tartalmaz, ami a készítmény parenterális célokra valló felhasználását nem gátolja. A kiindulási anyagot képező nyers hormonkészítmények rendesen mg-onként 0,15—0,25 egységnyi vazopresszint is tartalmaznak. A nyers hormon vazopresszinje, akárcsak az ACTH, proteinhez kötött formában van jelen. A meleg ecetsavas-sós kezelésnél a vazopreszszinnel asszociált protein túlnyomó része is kiválik az oldatból, a vazopresszin maga oldatban marad és akkor sem válik ki az oldatból, amikor az ACTH az oldatnak pl. konyhasóval való telítése után az oldatból kicsapódik. Az ACTH lecentrifugálása után ilyenkor a vazopresszin a sóoldatban marad. Az eljárás során tehát a vazopresszin-szennyezés túlnyomó részétől is megszabadulhatunk. így nyert készítményeink vazopresszin-tartalma nem nagyobb a gyógyszerkönyvekben (pl. USP XV) megengedettnél. A vazopresszin mentesítést az ACTH-t károsító hidrolízis nélkül érjük el. Savanyúan hidrolizált ACTH-k tudvalevőleg intramuszkulárisan, vagy bőr alá adagolva csekély klinikai értékűek. („B" típusú ACTH). A jelen találmány szerinti eljárásnak előnye, hogy a ballaszt anyagoktól és vazopresszin túlnyomó részétől mentes ACTH készítményt kapunk. Példa A 143.318. sz. szabadalomban leírt módon, acetonnal szárított hipofízis porból készített nyers ACTH 1 g-nyi mennyiségét feloldjuk 10 ml 90rt

/()-os jégecetben és az oldatot 5 percen át 80° C-on tartjuk. Az_oldatot lehűtjük 0—2° C-ra és kicsapjuk 20 ml —10° C-ra lehűtött peroxidmentes dietiléterrel. A csapadékot a felülúszótól eltávolítjuk és —15° C acetonnal mossuk és szárítjuk. A termék súlya 950 mg. Ebből 400 mg adrenokortikotrop hormont feloldunk 20 ml 2%-os ecetsavban és az oldathoz adagolunk 600 mg tiszta konyhasót. A zavaros oldatot 10 percre forró vízfürdőbe helyezzük, mire az oldat feltisztul. A forró oldatot ezután mágneses keverővel kihűlésig keverjük és az eközben kiváló csapadékot lecentrifugáljuk. A csapadékot leöblítjük 3 ml, 2% ecetsavat és 3% konyhasót tartalmazó 'oldattal, majd az egyesített vizes hormondldatokhoz 5,5 g nátriumkloridot adagolunk és az oldatot a só oldásáig keverjük. A ki-sózásra kiváló hormont ezután lecentrifugáljuk és acetonnal kiszárítjuk. Ily módon 70 mg hormonport nyerünk, amely 4—ötször aktívabb a nyers hormonnál, mg-ként 9,0—10,0 nemzetközi egység ACTH-t tartalmaz és ACTH egységenként 0,02 —0,03 egységnyi vazopresszint. Szabadalmi igénypontok: 1. Ejárás adrenokortikotrop hormon tisztítására frakcionált kisózással, melyre jellemző, hogy a nyers hormonnak valamely szerves, savval megsavanyított vizes oldatát 50 C°-t meghaladó hőmérsékletre melegítjük, melegítés előtt, vagy azzal egyidejűleg az oldathoz 2—6% előnyösen 3% NaCl-ot adunk, a legalább 30 C°-ra lehűtött oldatból kicsapódó ballaszt anya-