144237. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12-vitamin előállítására fermentáció útján metano baktériumok alkalmazásával

Megjelent: 1958. szeptember 15-én. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 144.237. SZÁM 30. h. 1-8. OSZTÁLY - RI-167. ALAPSZÁM Eljárás Bi2-vitamin előállítására fermentáció.útján metanobaktériumok alkalmazásával Bejelentő: Richter Gedeon Vegyészeti Gyár R. T., Budapest A bejelentő által megnevezett feltalálók: Dr. Cserei-Pechány Éva orvos-mikrobiológus, Dr. Molnár Béla kutatóvegyész, Wack Géza mikrobiológus, mindhárman budapesti lakosok Bejelentés napja: 1956. január 3. térium-csoport a termelő. Az izolálások helyett más módszert kerestünk és a megoldáshoz abból az irányból igyekeztünk közelebb jutni, hogy az igen komplex táptalaj (szennyiszap) bakteriális bontása során melyik az a fázis, ahol B;.2 vitamint nyerhetünk. Kísérleteinkben úgy jártunk el, hogy anaerob szenny vízderítés iszapjával beindítottunk több laboratóriumi rothásztót, ezekhez szennyiszap helyett különböző táptalajokat adagoltunk. Á táptalajok egy alap-sóoldatból és ehhez adott különböző fehérje, szénhidrát, alkohol vagy zsírsavféléből állottak. A beadagolás a szennyvíz-technológiában szokásos módon történt, eszerint 1—7 naponta a kísérleti rothasztóből (fermentcrból), bizonyos hányadot levettünk, majd ugyanilyen mennyiségben a megfelelő táptalajt beadagoltuk. Az: esetenként levehető minta mennyisége a fermentációs idő függvénye, az egyes levett térfogatok összege ugyanis egy teljes fermentációs idő alatt teheti ki a ferroentor egész; volumenét. A fermentációs idő megállapítására a B12 szint alakulását, vagy az esetleges gázfejlődés menetét használtuk fel. Mintavétel és betáplálás szeptikus körülmények között történt, a beadagolt táptalajokat nem. sterileztük. A levett mintákból Coli-mutans lemezes módszerrel B12 meghatározásti végeztünk, ennek eredményében természetesen a Coli baktériumot növesztő egyéb faktorok hatása is bennfoglaltatik. Kromatográfiás analízissel ellenőriztük a B12 vitamin ésBi2-szerű faktorok arányát. A kísérletek zömében ez az arány 1:2 körüli volt. Vizsgáltuk a fermentációs: minták szárazanyagtartalmát és pH értékét és mértük a keletkezett gáz mennyiségét. Kísérleteinkből megállapítható' volt: 1. Nagymolekulájú •szénhidrátok (keményítő, cellulóz) adása mellett az eredeti iszap értékének kb. megfelelő B12 szintet kapunk. A keletkező B12 nagy valószínűséggel a bontás későbbi szakaszából származik, ugyanis hetenkénti nagyobb volumenű beadagolás mellett a beadáskor leesett B12 érték csak egy latens szak után a 3—4. napon emelkedik, a gázképződés emelkedésével egy id őben. Ismeretes, hogy a szennyvízderítés iszapja Bia vitamint tartalmaz. Az: első irodalmi adatok levegőztetett derítés iszapjára vonatkoznak. (S. R. Hoover, Science 114. 213, 1951. Sew. Ind. Wast, 24. 38, 1952.) Ezt követően egyre több közlemény jelent meg az aerob, majd anaerob szennyvíztisztítás során keletkező B12 vitaminról és Bj2-szerű faktorokról. (W. Friedrich. Angew, Chem. 65. 627 1953. A. G. M. Sjostrom, Acta Chem. Scand. 7. 1036, 1953., H. Sommer, Vit. und Horm. 6. 134, 1954.) A 705 346 sz, brit szabadalmi leírás az ún. eleveniszap feldolgozását ismerteti B12 vitaminra, de kiterjed a rothasztott eleveniszap, vagy ülepített-rothasztott, — tehát csak anaerob körülmények között kezelt — iszap felhasználására is, A 922 126 sz. német szabadalmi leírás szerint a rothasztott iszap B12 tartalma a metán termelő rothasztás baktériumai működésének következménye. Ismerve a Bi2 termelő törzsek nagy számát és sokféleségét, szinte várható volt, hogy a szennyiszapnak igen vegyes baktériumflórával végbemenő rothasztása során B12 vitamin keletkezzék. Nem volt adat azonban arra, vájjon a B12 termelésben szerepe van-e a metánrothasztás minden baktériumának, vagy csak egyes törzsek B12 termelők és mellettük jelen vannak indifferens, sőt vitaminfelhasználó baktériumok is. Kísérleteket végeztünk tehát annak megállapítására, hogy az említett vegyes baktériumflórának, melyek a B12 vitamin termelő törzsei és ezek optimális életkörülményeinek tudatos biztosításával, hogyan tudjuk a metániszapban a B12 vitamin hozamot emelni. Első kísérletsorozatunkban a metániszapból több, mint. 20 különféle baktériumtörzset izoláltunk, ezeket B12 termelésre vizsgálva azt találtuk, hogy nagyrészük egyáltalán nem termel B12 vitamint és a kisebb számban található törzsekkel is csak jelentéktelen B12 mennyiségeket kapunk. Első feltevésünk ezzel igazolódott, miszerint sok baktériumfajta található a metánrothasztás iszapjában, mely B12 vitamin termelés szempontjából nem számottevő. Nyitva maradt azonban a kérdés, melyik baktérium vagy bak-