143902. lajstromszámú szabadalom • Eljárás heparin értékmérésére

Megjelent: 1958. január, hó 15-én. ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 143.902. SZÁM 42. 1. 3. OSZTÁLY — Rí—163. ALAPSZÁM Eljárás heparin értékmérésére Bejelentő: Richter Gedeon Vegyészeti Gyár r. t. Budapest. » Feltaláló: dr. Fekete György orvos-farmakológus, Budapest. Bejelentés napja: 1955. december 10. A véralvadás gátlására használt heparin, mennyiségi meghatározása kémiai úton bonyolult feladat az anyag nem teljesen felderített szerkezete miatt, a kapott értékek pedig nem mutatnak párhuzamot a heparin gyógyászati értékével. A heparin meghatározására általában biológiai módszerül: használatosak, melyek lényege az, hogy a vizsgálandó anyagot állati plazma alvadási idejének megnyújtása alapján hígiíási sorozatban egy standard készítmény alvadásgátló hatásához hasonlítják. Ez- a módszer kivitelében és értékelésében hosszadalmas. A heparingyártás közbenső fázisainak ellenőrzésére a biológiai értékmérés, hosszadalmas volta miatt, nem alkalmas. A gyártási folyamatok azonnali ellenőrzést igényelnek és leállításuk a vizsgálatok többórás időtartamára nem lehetséges. Ismeretes az irodalomból, hogy egyes bázikus fehérjék, így különösen a protaminok, pl. a protamin-szulíát o heparinnal vízben nem oldódó komplexet képeznek, miközben a heparin aktivitását veszti. (Lásd Chargaff E., Olson K. B., J'. Biol. Chem. 122, 153. 1938.) Több próbálkozás történt ennek a megfigyelésnek az értékmérés céljaira való felhasználására olyképpen, hogy ismeretlen- heparin-tartalmú plazmát protaminnal olvadásig titráltak és a fogyasztott protamin, valamint a heparin-protamin komplex egyenérték ismeretében a plazma heparintartalma kiszámítható, volt. (Lásd Kaller H., Arch. Int. Pharmacodyn. XCIX. 163, 1954.) A meghatározás szintén igen lassú, mivel minden' csepp protamin-szulfát hozzáadása után 3—4 percig kell várni, miután, a lesemlegesített plazmának ez a normális olvadási ideje. Mint ismeretes, a heparin-protamin komplex vízoldhatatlansága következtében vizes rendszerben rendzavarást idéz elő. Kísérleteket végeztünk a komplex által okozott fényelnyelés mennyiségi értékelésére. Kísérleti eredményeink szerint a heparin mennyisége és a keletkezett zavarosodás optikai sűrűsége között öszszefüggés van, amely fotometriásan mennyiségileg jól értékelhető. E módszer szerint felvett kalibrációs görbe 50—12,5 E/ml-es heparinoldatok esetén egyenes, később hajlásszöge csökken, de még 3,125 E/ml-es oldatok is jól mérhetők. A méréseket a találmány szerint úgy végezzük, hogy 1 ml, feltehetően 12—50 E/ml erősségű heparinoldatot 1 ml 1%-os vizes protamin-szul•íat oldattal összerázzuk. A zavarosodás maximuma 3 perc alatt jön létre, tehát a mérést 3 perccel az: összeöntés után kell elvégeznix A módszernek az említett biológiai értékméréssel való összehasonlítása azt mutatta, hogy a magas hatóértékű forgalmi készítmények esetén a módszerrel kapott eredmények megegyeznek -a biológiai értékmérés eredményeivel. Kisebb értékű termékeknél, pl. gyártásközi termékeknél az eredmények kis mértékben eltérőek, a találrhány szerinti módszerrel mért egységszám azonban a biológiai vizsgálattal mért egység.számot minden esetben felülmúlja, ami arra mutat, hogy-a módszer a nem teljes alvadásgátló értékű, de heparinszerű szerkezettel bíró szennyeződéseket is méri. A különbség, kísérleti megállapításaink szerint, a biológiai módszer szórásá,t, alig múlja felül. A találmány szerinti módszer tehát tisztított vagy tiszta hatóanyagok esetén (hatóanyag koncentráció 75—120 E/mg) értékmérésre, ny^rs, szennyezett termékek esetén tájékoztató vizsgálatra, illetőleg a biológiai értékkel vaó összehasonlítás révén a szennyezettség fokának megállapítására alkalmas. Igen nagy előnye, hogy mintegy 5 perc alatt könnyen megvalósítható, friss plazma beszerzését nem igényli, kémiai jellege miatt reprodukálhatósága a biológiai módszerekét felülmúlja és így jelentős mértékben megkönynyíti-a heparingyártás üzemközti ellenőrzését.