143502. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterinek mikrobiológiai oxidációjára
2 Példák: 1.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium subverticillatum-mal, íesztololaktonná. 2% szójalisztet, 2% kukoricalisztet és 0,5% kalciumkarbonátot tartalmazó táptalajt készítünk vízvezetéki vízzel. A pH-t 7.2-re beállítjuk, majd az így készített táptalajt 100 ml-es adagokban 500 ml-es Erlenmeyerlombikokba osztjuk szét és 121°-on 30 percig sterilizáljuk, majd 2 lombikot beoltunk Cephalosporium subverticillatum burgonyás ferde agar tenyészetéről' deszt. vízzel készült spóra-szuszpenzió l-l mijével. A tenyészetet rázóasziaira tesszük és 48 őrá"", át 28'-on rázzuk. 43 óra múlva a jól fejlett tenyészetekhez 20-20 mg progeszteront adunk 2%-os acetonos oldat formájában. További 8 óra után a fermentációt befejezzük (pH, 8,30), acetonnal és kloroformmal kimossuk, a fermentációs folyadékot kloroformmal kirázzuk, az egyesített extraháló folyadékokat bepároljuk és a visszamaradt olajat papirkromatográfiával vizsgáljuk. Metilciklohexánkarbíto] rendszerben azt az eredményt kapjuk, hogy a progeszteronnek kb. 40%-a íesztololaktonná alakult, a többi pedig androsztén-3,17-dion. 2.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium subycrticillatum-mal süllyesztett kultúrában. 2% kukoricalekvárt glükózt tartalmazó táptalajt készítünk csapvízzel, majd 7-es 'pH-ra állítjuk és 5 l-t ebből a táptalajból 10 l-es laboratóriumi üveg\fermentorba helyezzük, sterilezzük, majd beoltjuk Ceph. subvertic. 1 l-es burgonyás táp-agart tartalmazó Roux-palackból 50 ml desz. vízzel készített spóra-szuszpenziójával. A fermentort 2íi°-on ' tartjuk és 400-as fordulatszámmal kevertetjük, miközben 5 1 steril levegőt áramoltatunk rajta keresztül percenként. 24 órai tenyész-idő után (pH 5,40) 25 ml acetonban oldott 2 g progeszteront adagolunk hozzá. Újabb 24 óra fermentálás után (pH 8,60) a miceliumot lenuccsoljuk, 2x200 ml acetonnal és 2x200 ml kloroformmal extraháljuk. A micelium szürletét 2x2 1 és 2x1 1 kloroformmal extraháljuk, a kloroformos extraktokat egyesítjük, 2x600 mi vízzel mossuk, magnéziumszulfáton szárítjuk, majd vákuumban bepároljuk. A kapott kb. 2 gnyi barnás kristálymasszát 5 ml acetonból kristályosítjuk: 0,99 g tesztololaktont kaptunk, mely 204-205'"-on olvad, acetonból átkristályosítva pedig 208-209°-on. (<*) D+43° (kloroformos oldat), abszorpciós maximum 238 m-nál van. Papirkromatográfiai vizsgálat szerint propilénglikol-toluol rendszerben kb. olyan sebességgel fut, mint a 17 -oxi-progeszteron, karbitol-metilciklohexán rendszerben viszont a progeszteronnál jóval lassabban mozgó foltot ad. 3.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium subverticillatum-mal androszténdiónna. 2 g progeszteront a 2. példában leírt módon fermentálunk azzal a különbséggel, hogy á progeszteron hozzáadása után csak 4 órán át folytatjuk a fermentálást, A fermentátum pH-ja a kezdeti 6,58-as értékről 5,60-ra esett ezen idő alatt. A miceliumot lenuccsoljuk, acetonnal és kloroformmal a 2. példában leírt módon extraháljuk, a micelium szüredékét pedig 2x2 liter és 2x1 liter kloroformmal kirázzuk. Az egyesített extraháló folyadékokat nátriumbikarbonát^oldattal és vízzel semlegesre mossuk, magnéziumszulfáton szárítjuk és vákuurdban bepároljuk. A kb. 3,5 g-nyi olajos maradék papirkromatográfiás vizsgám^^ajján kb. 45% változatlan progeszteront, 35°/0 .502 W^^ androszt-4,5-én —3,17 diont, 15% tesztololaktor-1 és, kb. 5% ismeretlen szterin-származékot tartalma fentebbi olajat Brockmann H/3 aktivitású alt niumoxid oszlopon kromatograf álj uk. Az osz ról lefolyó kimosó folyadékok közül az 5% ace és 95% benzolt tartalmazó elegy bepárlásával : tályos androszt-4,5-én-3,17-dion volt kinyer! amelyet olvadáspontja, kever ék-olvadáspont jí papirkromatográfiás viselkedése' alapján azonos tünk. 4.) 3-Keto-bisznorkol-4,5-én-22-al oxidációja phalosporium subverticillatum-mal. Az 1. péld megadott módon 3-keto-bis,znorkol-4,5-én-2í oxidáltunk.. A szokott módon feldolgozott oxid termék propilénglikol-toluol lendszeiber1 véj papirkromatográfiás vizsgálat alapján 3-keto-bu.ínorkol-4.ö-én-22-al mellett egy sokkal lassabban x mozgó foltot mutatott. 5.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium coc«•idicolum Guégnem-mel. Az 1. példában leírt módon 0,04 g progeszteront; oxidálunk Cephalosporium coccidicolummal. Az acetonos és kloroformos extraktumok maradéka kb. 0,03 g világos olaj, melyet papirkromatográf iával vizsgálva azt találtuk, hogy változatlan progeszteron mellett egy erősen poláris és egy közepesen poláris vegyület keletkezett és kevés tesztololakton. 6.) Ergoszta-4,7,22-trién-3-on oxidációja Cephalosporium subverticülatum-mal. Az 1. példában leírt módon ergoszta-4,7,22-trién-3-on-t oxidálunk. A szokott módon feldolgozott fermentátum propilénglikol-toluol rendszerben végzett papirkromatográfiás vizsgálat alapján kevés kiindulási anyag mellett egy oxidált anyagnak megfelelő, sokkal lassabban mozgó foltot adó terméket tartalmaz. 7.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium charticola-val. Az 1. példában leírt módon 0,04 g progeszteront 10 órán át Cephalosporium charticola-val fermentálunk. A szokott módon való feldolgozás után kapott oxidációs termék papirkromatográfiás vizsgálat alapján 2 különböző, igen lassan mozgó, erősen poláris oxidációs terméket tartalmaz. 8.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium curtipes-szel. Az 1. példában leírt módon 0,04 g progeszteront fermentálunk 10 órán át. A szokott módon kapott reakciótermék papirkromatográfiás vizsgálat szerint progeszteront nem tartalmaz, ellenben csaknem kizárólag tesztololaktonból áll. 9.) Progeszteron oxidációja Cephalosporium car* pogenum-mal. Az 1. példában leírt módon 0,04 g progeszteront- Cephalosporium carpogenum-mal 20 órán át fermentálunk. A szökött módon való feldolgozás után kapott oxidációs termék propilénglikol-toluolos rendszerben végzett papirkromatográfiás vizsgálat eredménye szerint 3 különböző, a progeszteronnál lényegesen kisebb mozgékonyságot mutató foltot ad. Megjegyzés: A kromatogrammok előhívását úgy: végeztük, hogy a szokott módon való megszárításj után azokat p-fenilén-diamin ftálsavas sóját tar-j talmazó vizes oldattal bepermeteztük, majd 110°-oá szárítószekrényben 10 percig melegítettük. A fen-j tebb említett szterin-származékok barnás-vörös fol^ alakjában jelentkeztek a csaknem színtelenül ma-j radt alapon (ez a szín-reakció általában sokkal éri zékenyebbnek mutatkozott kísérleteinkben, mint aj előhívásnál általában használt 2,4-dinitrofenil-hidrazinos előhívási módszer).
