143424. lajstromszámú szabadalom • Eljárás szterinek oxidációjára

Megjelent 1957. március hó 1-én. 0 ___—. „ , ORSZÁGOS TALÁLMÁNYI HIVATAL SZABADALMI LEÍRÁS 143.424. SZÁM 12. o. 25. OSZTÁLY - Go-403. ALAPSZÁM Eljárás szterinek oxidációjára Bejelentő: Gyógyszeripari Kutató Intézet, Budapest, Feltalálók: dr. Wix György, dr. Bodánszky Miklósné és Kollonitsch János. Bejelentés napja: 1954. december 11 Azt találtuk, hogy á szterinek oxidált származékait előállíthatjuk olyan módon, hogy a szterineket Trichoderma viride által termelt oxidáló enzimek behatásának vetjük alá. A fenti eljárás egyik fontos kivitelezési módja abban áll, hogy Trichoderma viride tenyészetét aerob körülmények között az oxidálandó szteoríddal elegyítjük és a kívánt oxidációs fok eléréséig fermentáljuk. Eljárhatunk pl. olyan módon, hogy a Trichoderma viridet alkalmas szilárd táptalajon spóráztatjuk és erről a táptalajról készített spóraszuszpenzióval oltunk be megfelelő folyékony táptalajt, majd 1—3 napos tenyésztési idő után hozzáadagoljuk a táptalajhoz az oxidálandó szteroidot, majd a megfelelő és az oxidálandó szteroidtól függő fermentálási idő után az oxidációs termékeket önmagában véve ismert — szteroidok elkülönítésére és tisztítására általában használt — módszerekkel (pl. extrakcióval és kromatografálással) a fermentálási elegyből kinyerjük. Ha pl. progeszteronból indulunk ki, akkor a fenti módszerek alkalmazásával 11 a-oxiprogeszteront nyerhetünk, mely vegyület a gyógyhatású szteroidhormonok (pl. Cortison) előállításának fontos közbenső terméke. Példa : Trichoderma viride 5—14 napos burgonyás ferdeagár tenyészetéről spóraszuszpenziót készítünk desztillált vízzel. A kapott szuszpenzió 1—1 ml-ével oltunk be 100—100 ml 1% glükózt és 2% nedves kukoricalekvárt tartalmazó. 6-os pH-jú táptalajt. 50 ilyen beoltott lombikot rázóasztalra teszünk és az 1—3 napos, jól fejlett tenyészetekhez adagolunk 1—1 ml acetonban feloldva 20—20 mg progeszteront. Az adagolás után 2—4 napos rázatás után a lombikok tartalmát összeöntjük és feldolgozzuk. Az így kapott fermentációs elegyből az oxidációs termékeket szterinek kinyerésére és tisztítására általában használatos módszerek segítségével, pl. oldószeres extrakcióval és az azt követő kromatográfiával nyerhetjük ki. Pl. a következő módon járhatunk el: a fermentációs elegyet a miceliumtól Seitz-lapon megszűrjük, a miceliumot 2x100 ml acetonnal és 2x100 ml kloroformmal mossuk, a szüredéket 4x2 1 kloroformmal kirázzuk, az extraktokat egyesítjük és 800 ml 4%-os nátriumhidrokarbonát-oldattal, majd 800 ml n. sósavval és 2x800 ml deszt. vízzel kimossuk (az esetleg képződött emulziókat centrifugálással szétválasztjuk), magnéziumszulfáton szárítjuk és vákuumban 40° körüli hőmérsékleten bepároljuk. Az így kapott maradék tartalmazza a fermentációnál képződött oxidációs termékeket és súlya kb. 1,5—2 g körül szokott lenni. Ezt a maradékot célszerűen kromatografálással tisztítjuk. Eljárhatunk pl. a következő módon: 5 ml benzolban oldjuk az oxidációs terméket, majd 50 g Brockmann-féle aluminiumoxidot (aktivitás II—III) tartalmazó oszlopon kromatografáljuk. A kromatogramm kifejlesztéséhez, ill. az eluáláshoz sorban a következő oldószereket alkalmazzuk: benzol, 5% étert tartalmazó benzol, 10% étert tartalrrtazó benzol, 50% étert tartalmazó i benzol, éter, 5% kloroformot tartalmazó éter, 10% kloroformot tartalmazó éter. A kloroform tartalmú éteres frakció tartalmazza az oxidációnál képződött 11 a-oxiprogeszteron főtömegét és rendszerint teljesen szilárd kristályos terméket lehet ezen a helyen a bepárlás után kapni. Amennyiben szükséges, ezt a terméket metanolból átkristályosítva teljesen tiszta, 164—166°-on olvadó és +176° specifikus forgatóképességgel (1%-os kloroformos oldatban) rendelkező 11 «-oxiprogeszteront kaphatunk, mely papírkromatográfiás viselkedésre és autentikus anyaggal készített keverékének olvadáspontja alapján is azonosnak bizonyult. Ali a-oxiprogeszteron mellett a nyers oxidációs termékben egyébként papírkromatográfiás vizsgalat alapján még három, eddig nem azonosított oxidációs termék is jelen, van. (A papírkromatográfiás vizsgálatot Zaffaroni módszerével végeztük.)