143197. lajstromszámú szabadalom • Eljárás B12 vitamin-sűrítmények tisztítására
2 143.197 előnyt jelent, ha ezt az oldószer lepárolása nélkül közvetlenül végre lehet hajtani. A találmány szerint előállított rézcianidkomplex csapadékból annak elbontása után a hatóanyagot akár az ismert savas közegben végzett extrakcióval,’akár az ugyancsak ismeretes szenes abszorpciós módszerrel izolálhatjuk. De izolálhatjuk a hatóanyagot a találmány szerint akként is, hogy a csapadékot szűréssel vagy centrifugálással a fölös folyadékfázistó.l elválasztva tömörítjük, majd kb. %—1 súlyrész fenollal' elkeverjük és tömény (kb. 40%-os) NaCN oldatot csepegtetünk hozzá keverés közben. A csapadék melegedés közben megbomlik és a reakció befejezése után az összes hatóanyag azonnal különválik a fenolos rétegben. Az alsó barna vizes rész eléktrolitos szennyeződéseket tartalmaz. Ennek magas elektrolittartalma megakadályozza az emúlzió-képződést, ami a szokásos módon végzett fenolos átrázásnál gyakori, igen kellemetlen jelenség. A vizes részt mégegyszer kevés fenollal kirázzuk, az egyesített fenolos fázisból pedig a hatóanyagot apoláros oldószer (kloroform, széntetraklorid) és aceton vagy éter hozzáadásával átszorítjuk vizes fázisba. Átszorítás előtt célszerű a széntetraklorid-fenolos fázist előbb alkalikus, majd ’tiszta vízzel átmosni. Ez a módszer lehetővé teszi, hogy a fenol-apoláros oldószer-elegy arányának megfelelő megválasztásával, valamint az alkalikus és vizes mosás megfelelő alkalmazásával a hatóanyagot bomlástermékektől és túlnyomórészt a kísérő faktoroktól mentesen, mintegy szelektíven nyerjük ki. Az alábbiakban kísérletsorozatban ismertetjük a találmány alkalmazási módját és kísérleti adatokkal igazoljuk a találmány szerinti csapadékleválasztás meglepő műszaki előnyét az eddig ismert módszerekhez képest. Példa Kiindulási anyagként városi szennyvíz-üledék metános rothasztása után visszamaradó iszapból hőkezeléssel készített vizes kivonatot használunk, melynek B12-vitamin tartalmát 2 adszorpciós lépés segítségével ismert módon feldúsítjuk, nevezetesen a hatóanyagot először fuller-földre (bentonitra) adszorbeáltatjuk, majd ennek eluátumát aktív szénnel kezeljük. A hatóanyagot tartalmazó aktív szenet melegvízzel kimossuk, majd 65%-os meleg etanollal eluáljuk. Az így nyert alkoholos eluátumot, mely kissé sárgásán rózsaszínű, szárazanyagtartalma 3,58 mg/ml, tisztítjuk tovább a találmány szerint rézcianid-komplexen keresztül. Az alkoholos kivonat Bi2-tartalma E. coli lemezes módszer szerint közvetlenül mérve 27,2 gamma/ml. (Tisztasági fok: 0,76%). Minthogy E. coii érzékenysége nem specifikus és olyan esetekben, mikor a Bi2-vitamin mellett .más, vele rokon faktorok is jelen vannak, irreálisan magas értéket mutat, ezért a mérést elvégezzük úgy is, hogy előbb elektroforézis segítségével a kísérő faktorokat a Bi2-vitamintól elválasztjuk. (Holdsworth, E. S. Nature, 171, 148. 1953.) Ezzel a módszerrel a Bi2-vitamin tartalom 8,2 gamma/ml. Tisztasági fok: 0,23%. Az így megvizsgált alkoholos oldatból 4 X 500 cm3-es részleteket veszünk ki és azokkal a következő kísérleteket végezzük el: 1. 500 cm3 alkoholos kivonathoz 16,5 cm3- 10%-os vizes NaCN-oldatot adunk, a pH-t 10%-os HCl-val pH 7,5-re beállítjuk, 25 cm3 25%-os vizes CuS4-5H>0 oldattal a rézcianid komplexet leválasztjuk, a csapadék leválása után a pH 2,6-ra állt be. A csapadékot lecentrifugáljuk, 5%-os vizes NaCN-oldattal beoldjuk és az így nyert oldatot 1 g aktív szénnel kezeljük. Ez a szénmennyiség gyakorlatilag a teljes hatóanyagtartalmat felvette. A szén vizes kimosása után a hatóanyagot 65%-os meleg etanollal leoldjuki Az így nyert oldat összes B12-vitamin tartalma közvetlen méréssel 11,5 mg (kiindulási anyagra számítva 84,5%), elekroforézises elválasztás után 3,83 mg (93,5%), szárazanyagtartalma 96 mg. Tisztasági fok: 12% (16-szoros tisztulás) közvetlen B12 mérésre, 4% (18-szoros tisztulás) elfő elválasztásos mérésre. 2. 500 cm3 alkoholos kivonatot alkoholmentesre párolunk, majd vízzel az eredeti térfogatára hígítjuk vissza. Ezután hozzáadunk 16,5 cm3 10%-os vizes NaCN-oldatot. 10%-os HClval pH 7,5-re savanyítjuk, majd 25 cm3 25%-os vizes CuSO4 • 5H’O-oldattal a rézcianid komplexet leválasztjuk, a pH 2,65-re állt be. A csapadék további feldolgozása úgy történik, mint az 1. alatti kísérletben. A szén leoldásával nyert alkoholos oldat öszszes hatóanyagtartalma közvetlen méréssel 10,4 mg (76,5%), elektroforetikus elválasztás után 3,83 mg (93,5%), szárazanyagtartalma' 91 mg. Tisztasági fok: (közvetlen B12 mérésre) 11,5% (15-szörös tisztulás), (elfő elválasztásos mérésre) 4,2% (18-szoros tisztulás). 3. 500 cm3 alkoholos kivonatból az 1. alatti kísérletben ismertetett módon leválasztjuk a rézcianid komplexet. A lecentrifugált csapadékot súlyának fele mennyiségű fenollal elkeverjük és addig adunk hozzá tömény (kb. 40%-os) vizes NaCN oldatot, míg a pH 9,0-re áll be. A fenolos fázis elválasztása után a vizes maradékot az előzőleg használt fenol mennyiségének felével kirázzuk, elválasztás után a két fenolos fázist egyesítjük. Hozzáadunk kétszeres térfogatú széntetraklqridot, majd tiszta vízzel átmossuk. Ezután egy térfogat aceton hozzáadásával a hatóanyagot kevés vízbe szorítjuk át. Az így nyert vizes oldat hatóanyag tartalma közvetlen méréssel 10,35 mg (76%), elfő elválasztás után 3,8 mg (92,5%), szárazanyagtartalma 93 mg. Tisztasági fok közvetlen méréssel: 9,6% (13- szoros tisztulás), elfő elválasztás utáni méréssel 4,08% (18-szoros tisztulás). 4. 500 cm3 alkoholos kivonatot alkoholmentesre párolunk, majd vízzel eredeti térfogatára egészítjük ki. Az előző kísérletekkel szemben a rézcianid-komplex csapadékot a leírás bevezetésében említett ismert módszer szerint állítjuk elő. azaz hozzáadunk 16,5 cm3 10%-os vizes NaCN-oldatot, amikor is a pH 10,2-re áll be,
