142793. lajstromszámú szabadalom • Eljárás cianokobalamin előállítására
2 142-793 használata esetén benzolmentes alkoholos vitaminoldatot nyerünk, mert a kismennyiségű benzol a szénen megkötődik és az adszorbens aktív felületéről az adszorbeált kobalamint leszorítva, annak leoldását előmozdítja. A komplexképzésből és szenes adszorpcióból öszszetevődő művelet sokszoros tisztaságú kobalamin oldatot eredményez az eredetihez hasonlítva. Előnyös tulajdonsága, hogy megismétlése esetén is jó hatásfokkal alkalmazható, mert egy művelet két különböző típusú lépést foglal magába. Másik előnye, hogy kivitelezése semmi technológiai nehézséget nem okoz, és úgyszólván veszteség «nélkül megvalósítható. Ezt elsősorban a 142.586. szabadalmunkban leírt eluciós eljárásunk biztosítja, mely a szenes, vitamin-adszorbeátról a vitamin kvantitatív leoldását teszi lehetővé. Egyes esetekben a szenes elució szárazmaradékának, tehát tisztítási módszerünk végtermékének kristályosodó képessége megjavul, ha az eljárás megismétlése, a kamplexképzés 2-ik alkalmazása elé egyetlen benzilalkoholos kirázást iktatunk. A szénről nyert eluciós oldatot e célból vákuum bepárlással alkoholmentesítjük, a visszamaradt vizes oldatban 20% ammonszulfátot oldunk, és az oldatot 9,0 feletti pH mellett benzilalkohollal extraháljuk. A benzilalkoholos kivonatot szerves oldószerrel (pl. benzin-benzol 2:1 arányú keverékével) meghígítjuk, és a kobalamint a szerves oldószerből vízzel kivonatoljuk. A vizes oldatból a kobalamint minden további kezelés (pl. éteres extrakció) mellőzésével azonnal ismét rézszulfát és alkáliéi anid oldattal elegyítjük, a kapott kobalamin-fémkomplexet tartalmazó csapadékot pedig a már ismertetett módon kezeljük tovább. A benzilalkoholos extrakció közbeiktatása akkor előnyös, ha kiindulási anyagunk olyan különböző típusú kobalamineket tartalmaz, melyek a ciano>kobalamin kristályosodását zavarnák, és amelyek benzilalkoholba nehezen rázhatok át. Az extrakció után javarészben a vizes fázisban maradunk. Példák 1. Kiindulási anyag 200 1 streptomicin fermentléből a 142.586. és 142.643. sz, szabadalmunkban leírt montmorillonitos és egyszeri szenes adszorpció-eluciós eljárással előállított 40 mg B12 -vitammt tartalmazó oldat, melynek szárazanyagtartalma 1,08 g, térfogata 33 ml. Az oldathoz 1 mólos rézszulfát és KCN 10—10 ml-nyi oldatát elegyítjük, és a keletkezett csapadékot 1 órai állás után lecentrifugáljuk, majd 3 X 50 ml deszt. vízzel kimossuk. A kimosott csapadékot feloldjuk 10 ml 1 mólos natr. cianid oldatban, majd kis (2,5 cm átm.) porcelán nuccsra enyhe szívatással rászűrünk 0,5 noritból és 1 g diatomaföldből készített szuszpenziót, a kapott szenes rétegen pedig lassú iramban átszívatjuk a vitamin natr. cianidos oldatát. A szénréteget kimossuk 200 ml vízzel és 15 ml 10%-os alkohollal, majd a vitamin leoldására átszívatunk rajta 50 ml 67%-os 50—60 C°-ra felmelegített alkoholt, végül 20 ml 3% benzolt tartalmazó alkoholt. Az alkoholos oldatot vákuumban szárazra pároljuk, majd a visszamaradó vörös színű szárazanyagot felvesszük 2 ml 75%-os acetonban és az acetonos oldathoz cseppenként tartós homályosodásáig absz. acetont csepegtetünk, mire a vitamin kristályosodása megindul. A leszűrt, 80°-on szárított vörös tűkből álló anyag súlya 28 mg. A kristályosítási anyalúgból további 5 mg kristályos terméket nyertünk ismételt fémkomplexes kicsapás — adszorpciós tisztítás után. 2. Kiindulási. anyagul 40 kg nedves csatornaiszapból nyert vizes kivonat szolgált, amelynek mikrobiológiai módszerrel mért kobalamin tartalma 55,5 mg, szárazanyagtartalma pedig 4,0 g volt. ' A fémkomplex képzésére 40—40 ml 1 mólos rézszulfát és káliumcianid-oldatot öntöttünk az oldathoz. A keletkezett csapadékot vízzel mostuk, majd 125 ml 1 mólos kai. cianid oldatban feloldottuk. A lilásvörös színű oldatot a kobalamin adszorpciója céljából 9 g norittal kezeltük, melyet nuccson vízzel, majd 10%-os alkohollal addig mostunk, mig a mosóoldat színtelenül csepegett le. A vitamin elucióját 67%-os alkohollal majd ugyanilyen, de 3% benzolt is tartalmazó alkohollal végeztük, és az oldatot vákuumban alkoholmentesre pároltuk be. Az így nyert vizes oldat átlátszó vérvörös színű, térfogata 115 ml. Oldottunk benne 20% ammonszulfátot, és pH-iát beállítottuk 30%-os NaOH hozzáadásával pH 9,3-ra, majd kivonatoltuk összesen 60 ml benzilalkohollal. A benzilalkoholos kivonathoz 60 ml benzin-benzol (2:1) elegyét öntöttük, és visszaráztuk a kivonatban foglalt kobalamint 60 ml vízbe. A vizes fázisból a kobalamint ismét kobalammfémkomplex alakjában csaptuk ki 10—10 ml 1 mólos CuS04 és KCN oldat segítségével, a képződött csapadékot vízzel kimostuk és oldottuk 15 ml KCN oldatban. Az oldott dicianokobalamint 1,5 g szénre adszorbeáltattuk, a szenes adszorbeátot vízzel, kevés 0,1 n. sósavval, majd ismét vízzel mostuk, míg a mosóvíz pH-ja 6,0—7,0 volt. A vitamin elunálását 50%-os etanollal, befejezésül 3% benzolt tartalmazó etanollal (67%) végeztük. Az alkoholos oldat bepárlása után visszamaradó szárazanyag kobalamin-tartalmia 25—30% (mikrobiól. meghatározás szerint). Vizes acetonból kristályosítva a vitamint, 35,5 mg elsődleges terméket nyertünk, mely szennyezést alig tartalmazott. Egyszeri átkristályosítás után gyógyszerkönyvi minőségű terméket állítottunk elő belőle. A kristályosítási anyaglúgból további tiszta terméket nyerhetünk. Folyamatos gyártásnál az anyalúgokat összegyűjtve dolgozzuk fel. * Szabadalmi igénypontok 1. Eljárás cianokobalamin előállítására vizes oldataiból, melynél a kobalamint — magában véve ismert módon —• komplex fémcianid-kobalaminvegyület formájában lecsapjuk, azzal jellemezve, hogy a csapadékot vízzel kimossuk, alkáli-cianid oldatában feloldjuk, az így nyert lúgos kémhatású dicianokobalamin oldatból a vörös színű kobalamint aktív szénre abszorbeáltatjuk, a szenes adszorbeátot vízzel elegyített szerves oldószerrel eluáljuk, az elució folyamán nyert oldatot szárazra pároljuk, és a száraz maradékból a cianokobalamint kikristályosítjuk.
