142367. lajstromszámú szabadalom • Eljárás nyers heparin tisztítására
O 142.367 hatóértékü heparint, iaz előző lépésben kapott oldatból pontosan definiált hőmérséklet és konyhasókoncentráció mellett olyan menhyiségü vízzel-elegyedő oldószerrel választjuk le, mely a heparinnak mintegy 90%-át kicsapja, de a hatástalan polisaccharidákat kevés heparinnal együtt még oldatban tartja. E frakciónál! kicsapás eredményeként teljes tisztaságú heparin-nátriumot kapunk, mely szárítás után 90—120 lE/mg antikoagulációs hatáserősséget mutat. Az anyalúg oldószer-koncentrációjának fokozásával a még oldatban maradt heparin is kitermelhető mintegy 20—40 IE mg erősségben polisaccharidákkal szennyezve. Ezt a szekunder terméket a harmadik lépés megismétlésével tisztíthatjuk. Az eljárás részleteit az alábbi példában ismertetjük, a találmány azonban nincs a példa adatszolgáltatására korlátozva. így pl. fehérjelecsapó - szerként nemcsak szulfoszalicilsav használható, hanem triklórecetsav, foszforwolfrámsav stb., a színező anyagok leválasztása történhetik az eljárás korábbi vágj’ későbbi stádiumában is, stb. Példa: 1 kg nyers heparint, mely 10 lE/mg hatóanyagot tartalmaz, feloldunk 20 1 vízben, melyhez előzőleg 200 g konj rhasót adtunk. Enyhe melegítés után a pH-t 9-re állítjuk be, és ezen a pH-n folytonos keverés közben az anyagot felforraljuk. Kihűlés után az oldatlan részt elkülönítjük, és az oldatból 16 1 96 %-os alkohollal, hütött körülmények között, a hatóany’agot lecsapjuk. A csapadékot dekantálással és centrifugálással izoláljuk, majd alkohollal eldörzsölve, szárítjuk. A termék szurokfetoete színű, súlya kb. 300 g, hatásértéke 30—35 lE/mg. Az anyagot darabos alakban dializáló térbe töltjük és desztillált víz ellenében dializáljuk. A hatóanj’ag a dializálás során a dializáló térben feloldódik, az elektrolitoktól megszabadul, azonfelül szürhetővé válik, mert kolloid-szennyeződései összefüggő vázként a dializáló tér alján maradnak. A szennyeződéstől az oldatot centrifugálással szabadítjuk meg. Az összegyűjtött szupernatánst 4 1-re egészítjük ki. pH-ját 9-re állítjuk be, és hozzáadunk 80 ccm 30 %-os hidrogénhiperoxidot. Egynapi állás után az oldat pH-ját 6-ra állítjuk be, 4-5 C’-ra lehűtjük, és 120 g szulfoszalicilsavnak 240 ccm vízben való 4- 5 C’-ra hűtött oldatát adjuk hozzá. A képződött csapadékot azonnal centrifugáljuk. A szupernatánst összegyűjtve, 40 g konyhasó hozzáadása után, 6 14-5 C°-ra lehűtött alkohollal elegyítjük. Hűtött térben rövid ideig való állás után a leülepedett csapadékot dekantáljuk, majd centrifugáljuk. A csapadékot 1.5 1 desztillált vízzel kioldjuk, Seitz szűrőn tisztára szűrjük. A tiszta szürlet pH-ját 8,5-re beállítva, 15 g konyha sót adunk hozzá, majd enyhe melegítés után az oldatot 42 tf.% 96%-os alkohollal kicsapjuk. A kicsapott elegyet 2—3 órán át 4-2----1-4 C° közötti hőmérsékleten tartjuk, majd a kivált csapadékot hütött 'körülmények között centrifugáljuk. A szupernatánst félretesszük, a csapadékot pedig szárítás céljából 96%-os alkoholban szuszpendáljuk. {»orcelánnuccson leszűrjük, majd exszikkátorban szárítjuk. Az ily módon előállított tiszta heparinnátrium súlya 70—90 g, halványsárga színű, fehérje és depresszor anyagoktól mentes. Hatáserössége a nyeredék mennyiségétől függően 90—120 lE/mg értékek között változik. A csapadék alkoholos leszárításának szürletét 900 ccm-re Kiegészítjük, és a félretett alkoholos szupernatánshoz öntjük. Egy napon át .hűtött térben való állás után alacsonyabb egységszámú (20— 40 lE/mg) heparin-nátrium válik ki. A folyadék tisztáját leöntjük és a csapadékot centrifugáljuk. E szekunder csapadéknak tiszta termékké való feldolgozásával a találmány szerinti eljárás egységben kifejezett hozadéka a kiindulási nyers he parin értékére számítva 85—90%. A letisztított heparint, szükség esetén, ismert módon pirogénmentesí th etjük. Irodalom: 1. Charles —Scott: Biochemical Journal 30, 1936, 1924. 2. Charles —Scott : J. Biol. Chem. 102, 1933, 425. 3. Kretschetowa —Jankowski: Chimiko-pharmazewtitscheskaja Promyslenost 1933, 225. 4. A. Schmitz— A. Fischer: Hoppe-Seylers Z. f. Phys. u. Ch. 216. 1933, 264. 5. Charles —Scott: Trans: Roy. Soc. Canada (sect. 5) 28, .1934, 55. 6. Astrup: J. Biol. Chem. 124, 1939, 309. 7. Kuizenga —Spaulding: J. Biol. Ohem. 148, 1943. 641. 8. Wolfram —McNelley: J. Americ. Chem. Soc. 67, 1945. 748. 9. Homan —Lens: Bioch. et Bioph. Acta 2, 1948. 333. 10. Olle Snellmann: Acta Chem. Scand. 3. 1949. 584. 11. 2,410,084 sz. amerikai szabadalom. 12. 835.925 sz. német szabadalom. Szabadalmi igénypontok: 1. Eljárás nj’ers heparin tisztítására, melyre jellemző, hogy a kísérő szennyeződéseket adszorbciós eljárások és sóképzés mellőzésével, előzetes feldúsítás után, csoportonként megfelelő reagensekkel távolítjuk el az oldatban lévő heparin mellől anélkül, hogy a műveletek közben a hatóanyagot minden alkalommal izolálnék. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, melyre jellemző, hogy a nyers heparint oldatából frakcionált alkoholos kicsapással feldúsítjuk, a csapadékot dializáljuk, a dialízis útján nyert oldatból a fehérjéket és fehérjelebomlási termékeket előnyösen hűtött körülmények között kicsapó szerekkel leválasztjuk, végül a magas egységszámú heparint az oldatból frakcionált lecsapással nyerjük ki. 3. Az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy az első lépésben feldúsított heparincsapadékot szilárd alakban dializáljuk desztillált vízzel szemben. 4. A 1.—3. igénypontok szerinti eljárás kiviteli módja, azzal jellemezve, hogy a színező anyagokat
