140151. lajstromszámú szabadalom • Eljárás virusz proteinekelválasztására nem viruszos proteinekből
2 140151 adunk a viruszproiteinek oly vizes szuszpenziójához, amelynek pH-ja 5 és 8 között és ionerőssége 0,005 és 0,25 között van, -hőmérséklete pedig' 5 C°-nál alacsonyabb, amidőn is az alkoholt oly mértékben adjuk a viruszhoz, hogy a proteinek denaturálását elkerüljük, a lecsapódott viruszproteineket pedig összegyűjtjük. Az alant leírt kísérleteknél a PR8, a Weissféle és Lee-féle influenzavirusztörzseket használtuk. Ezekét a viruszokat termékenyített és 11 napig keltetett Leghorn tojásokban tenyésztettük ügy, hogy a viruszt a héjnak a légbuborék fölötti kis nyílásán át az embrió allantoidális zacskójába oltottuk. A fertőzött embriókat 35.5 C°-on 42—48 órán át tovább keltettük, a keltetést további 6—8 órán át szobahőmérsékleten folytatjuk, majd pedig a tojásokat 4 C°-ra lehűtöttük, és az aszeptikusán összegyűjtött allantoidális folyadékot használtuk kiindulási anyagul. 100 cm3 Weiss-féle allantoidális folyadékot 1 C°-ra lehűtöttünk és —40 C°-ra lehűtött 95%-os etanolt adtunk hozzá cseppenként addig, mig a különféle adagokban 15, 20, 25, ill. 30%-os alkoholtöménységet értünk el. Az allantoidális folyadék és alkohol keverékének hőmérsékletét fokozatosan csökkentettük, amint az alkohol töménységét növeltük úgy, hogy az utolsó alkoholrészletek hozzáadásakor a keverék —5 C^-ot ért el. A keveréket mintegy 3 órán át pihentettük —5 C° hőmérsékleten és azután 30 percen át percenként 3500 fordulattal centrifugáltuk l-es nemzetközi méretű, szögfejű centrifugában. A centrifugálást —5 C°-on végeztük és a felül úszó folyadékot elöntöttük. A csapadékot újból szuszpendáltuk 10 cm3 0,1 moláris 7 pH-s foszfátpufferoldatban és 1 órán át pihentettük szobahőmérsékleten. A szuszpenziót másodszor centrifugáltuk 2000 percenkénti fordulattal 15 percen át, ugyanazon fajta centrifugában, azzal a különbséggel, hogy a centrifugálás szobahőmérsékleten történt. A proteincsapadékról könnyen dekantálható folyadékban meghatároztuk a jelenlévő viruszmennyiségben CCA egységekben. Az 1. táblázatban feltüntetett eredmények mutatják, hogy a yiruszhozadék 92%-ot ért el, ha a végső alkoholtöménység 25% volt, míg 20, ill. 30%-os alkoholtöménység mellett 51, ül. 58%-os hozadékot lehetett elérni. 1. táblázat. II Weiss allantoidális folyadék, kiindulási anyagként Weiss allantoidális anyag kétszeresen töményített — 67 — 15 28 21 20 69 51 25 123 92 30 78 58 A 2. táblázaton láthatók a Lee-féle allantoidális folyadékkal elért eredmények, metanol hozzáadásával, a fentiekhez hasonló körülmények között. 2. táblázat. hfl # F-H <J ft XD O m s "d a >» JS § (fl-pi. -ÍJ N ,+i «© a O :.i a JS Lee-féle allantoidális folyadék, kiindulási anyagként — 141 — Lee-féle allantoidális folyadék, 10-szeresen töményítve* 15 1020 72 20 1350 96 . • „ 25 1410 100 30 1380 98 Hasonló eljárással 85—95% hozadékot kaptunk a Lee-féle virusszal, ha az etanol végtöménysége 35% volt. A táblázatból kitűnik, hogy 25%-os metanollal 100%-os hozadékot értünk el és hogy a hozadék 98, ill. 96%-ra csökkent, ha a metanol töménysége 30, ill. 20% volt. A metanol optimális töménységének azonban nincs akkora befolyása, mint az etanól-nál, és igen jó hozadékot értünk el a metanol töménységének aránylag tág határai között. A Weiss-virusszal fertőzött allantoidális folyadékkal végzett kísérletek azt mutatták, hogy mintegy 100%-os hozadékot lehetett elérni 25 %-os metanollal, mig a PR8 virusszal fertőzött allantoidális folyadéknál kissé kevesebb, vagyis 21% metanollal érhető el az optimális eredmény. Az alkoholos lecsapás a fenti módszer szerint az idegen proteinek mennyiségét nagy mértékben csökkenti, de még mindig nagyobb a kívánatosnál. Ezt a maradékot ugyan ismételt alkoholos lecsapolással is el lehet távolítani, azonban az eljárás ezen szakaszában célszerűbb a maradványproteineket centrifugálással kiküszöbölni. 100 cm3 prezerválószermentes fertőzött allantoidális folyadékhoz 500 cm3 abszolút metilalkoholt adtunk, a fent leírt módon. A keveréket 3 órán át —5 C°-on tartottuk, majd pedig 3500 perc-fordulattal 30 percen át centrifugáltuk, ugyancsak —5 C°-os hűtőkamrában. A könnyű folyadékot elöntöttük, a csapadékot pedig 200 cm3 0,1 moláris 7 pH-s foszfátpufferoldatban szuszpendáltuk és szobahőmérsékleten egy órán át pihentettük, mire az oldhatatlan proteinejket 2000 perc-fordulattal 15 percen át kicentrifugáltuk, ugyancsak szobahőmérsékleten. A folyadékot üyként az eredeti kiindulási anyaghoz képest 7 és félszeresen töményítettük. Az úszó folyadékot Sharpless laboratóriumi centrifugában 50.000 perc-fordulattal 30 percig kezeltük, ezután pedig egy liter 0,1 moláris, 7 pH-s foszfát-pufferoldatot folyattunk a centrifugaedényen keresztül, óránkénti 1 literes sebességgel, az 50,0*00 perc-fordulat fenntartása mellett. A centrifugaedény tartalmát rázassál a foszfát-pufferoldatban újból szuszpendáltuk és a végső térfogatot 300 cm3 -re hoztuk, miáltal á töménység az eredeti allantoidális folyadék ötszörösének felelt meg.
