Kelemen Imola (szerk.): A Csíki Székely Múzeum Évkönyve 6. (Csíkszereda, 2010)
Természettudományok - Pálfi Mária–Kovácsi Erika–Szilágyi László–Miklóssy Ildikó–Ábrahám Beáta–Lányi Szabolcs: Egy „világító” fehérje alkalmazási lehetőségei a környezeti biomonitoringban
si elve a következő: amikor az ólom bejut a baktérium citoplazmájába, egy receptor fehérje érzékeli azt és beindítja a zöld fluoreszcens fehérje termelését. A fluoreszcencia intenzitás mértékéből következtetni lehet az ólom mennyiségére. Romániában ilyen irányú kutatást még nem folytattak. Jelen kutatásunk célja a GFP irányított mutációjával egy olyan mutáns fehérje létrehozása, amely alkalmas lehet fémionok kimutatására. Azért választottuk ezt a fehérjét, mert fluoreszkáló tulajdonsága előnyösen felhasználható fém ionok monitorizálására. A fehérje által kibocsájtott fény viszonylag könnyen detektálható. Ahhoz, hogy az EGFP alkalmas legyen fémionok detektálására, szükséges, hogy képes legyen az adott fémion megkötésére, valamint a fém megkötése egy detektálható változást idézzen elő a fehérje fluoreszcenciájában. Tudva azt, hogy a fémionok, ha elég közel kerülnek a kromofor csoporthoz, csökkentik a fehérje fluoreszcenciáját, célunk kialakítani egy fémkötőhelyet a kromofor csoport közelében. így a fémionok jelenléte kiváltja a fluoreszcencia intenzitásának csökkenését. A fémkötő hely kialakítása helyspecifikus mutációval történt. A fehérje szerkezetében a kívánt változtatásokat DNS szinten végeztük. Kiindulva abból, hogy a fémionok nagy affinitást mutatnak a hisztidin iránt, a fehérje polipeptidláncában, kromofor csoport közelében lévő, két aminosavat (a 202 pozícióban lévő szerint és a 204 pozícióban lévő glutamint) kicseréltük hisztidinre, és így létrejött egy fémkötő régió. A mutáns fehérjét kódoló gént bejuttattuk baktérium sejtekbe (E. coli, Star sejtvonal), amelyek megtermelték a mutáns fehérjét. Ezt követően a sejteket lizáltuk. A lízátumból a DNS-t kicsaptuk, majd centrifugálással eltávolítottuk a nagyobb sejtalkotókat és a kicsapódott DNS-t. Az így kapott oldat tartalmazza a baktérium sejtek által termelt fehérjéket. A cél fehérje elválasztása a sejt egyéb fehérjéitől affinitás kromatográfiával történt. Vizsgáltuk a különböző fémionok (Cu , Fe2+, Ni2+) hatását a fehérje fluoreszcenciájára. A mutáció sikerességét úgy ellenőriztük, hogy összehasonlítottuk a vad típusú és a mutáns fehérje fluoreszcencia intenzitását különböző fémek jelenlétében. A fehérje oldathoz adagoltuk sorra a megfelelő mennyiségű fémsók oldatát, úgy, hogy az oldatban a fémek végső koncentrációja mikromólos tartományba legyen. A fluoreszcencia intenzitás változását fluoriméterrel mértük. Azt tapasztaltuk, hogy a fémionok jelenlétében csökkent a mutáns illetve vad típusú fehérjék által kibocsájtott fluoreszcencia intenzitása. Azonban a mutáns fehérje jóval érzékenyebb volt a fémionok jelenlétére mint a vad típusú fehérje, ezt jól szemlélteti a 2. ábra. Mindkét fehérje esetében a rézionok jelenlétében tapasztaltunk a legnagyobb fluoreszcencia intenzitás csökkenést. ___________________________EGY,, VILÁGÍTÓ’’ FEHÉRJE ALKALMAZÁSI LEHETŐSÉGEI... Rézion koncentráció (uM) 2. ábra. Fluoreszcencia intenzitás csökkenése rézionok jelenlétében 519
