Dr. Kassai Tibor - Dr. Murai Éva szerk.: Parasitologia Hungarica 10. (Budapest, 1977)

Antigén. A MP-ban élő, a fenti módon izolált lárvák, ill. ezek un. metabolikus vagy funkcionális antigénjei vesznek részt a reakcióban (18, 13, .17), A KKR-ban NEMESÉRI és VIZY (12) által leírt módon szárított, porított lárvák ecetsavas - sós extractiója révén nyert antigént használtuk. Az IHA-ban alkalmazott antigén TANNER és GREGORY (20) módszerével készült, kisebb technikai módosításokkal. Az eljárás során 4 g nedves lárvamasszát 50 ml PBS-ben, SORVALL homogenizátor "Microhomogenizer Attachement"-jével, kvarchomok hozzáadása után, maximális fordulatszámmal (40 000 rpm) 15 percig homogenizálunk jégfürdőben. 4°C-on történő 24 órás extractió után. az-ariyagot 10 000 rpm-el 20 percig centrifugáljuk, s a szúpernatanst használjuk antigénként (TSE). Az antigén fehérjetartalma 2 charge-ban biuret-módszerrel meghatározva 3,2, ill. 3, 6 mg/ml volt. A MP és KKR kivitele és értékelése NEMESÉRI és VIZY (12) már idëzett közleményében leírt módon történik. Az •IHA teszthez a birkavörösvérsejtek (SRBC) csersavas kezelését és szenzibilizálását BOY DEN módszerének (1) STAVITSKY szerinti módosításával (19) végeztük. Az eljárás lényege a következő: Mosott SRBC-t 2,5%-os szuszpenzióban inkubálunk 37°C-on 10 percig ää mennyiségű 1:40 000 csersavoldattal, majd mossuk pH 7, 2 PBS-sel. 1 vol. 2,5%-os csersavval kezelt SRBC szuszpenziót elegyítünk 4 vol. szenzibilizáló oldattal. A szenzibilizáló oldat 0,15 M - pH 6,4 PBS és titrait mennyiségű TSE elegye. Az antigén (TSE) optimális mennyisége 100 ml csersavazott SRBC szuszpenzióra általában 10 ml-nek bizonyult, ez fehérjetartalomban 0, 30 - 0, 35 mg/ml értéknek felel meg. A szenzibilizálás inkubációs ideje 30 perc szobahőn. Az ezt követő mosást 1:200 hígítású inaktivált nyúlsavót tartalmazó PBSsel (PBS-R) végezzük, s a SRBC reszuszpendálása is ebben történik 2, 5%-os végkoncentráciőban. Az IHA kivitele és értékelése. TAKÁTSY "Mikrotitrátor" V-lemezein az inaktivált vizsgálandó savókból 0,025 mles .kacsokkal 2-2 parallel higitási sort készitünk. A higitó folyadék PBS-R, melyből 1:2 hígítási sor készítésekör" l-l cseppet (0, 025 ml-t), 1:3 hígítási sor esetében pedig 2-2 cseppet (0,05 ml-t) mérünk a titráló lemezek V lyukaiba. A diagnosztikus vizsgálatokat rendszeresen 1:2 hígítási sorral végeztük. Magas titerü agglutináció esetén a végtiter megállapítása 1:3 hígítási sorral történt.- Minden szerológiai vizsgálat alkalmával legalább 1 negatív és 1 pozitív savókontrollt, és egy nyúlsavós-só kontrollt (PBS-R kontrollt) kell beállítani. A negatív és pozitív savókból ugyanúgy hígítási sort készítünk, mint a vizsgálandó savókból, a PBS-R kontroll készítésekor pedig 2 parallel V lyukba l-l csepp (ill. 1:3 hígítási sor esetén 2-2 csepp) hígító folyadékot cseppentünk. Ezután valamennyi lyukba l-l csepp szenzibilizált SRBC szuszpenziót mérünk, s ezt.a lemezek enyhe ütögetéséyel és rázógatásával egyenletesen eloszlatják. Egy-egy szenzibilizált SRBC charge készítésekor a csersavazott nem szenzibilizált vörösvértestek alaki sajátságait, spontán agglutinációra'való hajlamát, ülepedés! készségét is meg kell vizsgálnunk. Amennyiben az így kezelt vörösvértestek csillag alakúak, zsugorodottak, vagy a titrálólemez V lyukaiban nem alkotnak jól körülírt, gombszerú üledéket, esetleg részleges lizist észlelünk, úgy ezek nem alkalmasak az IHA elvégzésére. 1 órás 37°C-on történő inkubáció után az eredmény leolvasható, ill. a pozitív savókontroll megfelelő eredménye, és a többi kontroll negatívitása esetén értékelhető. Negatív esetben a V lyuk csúcsában kis, éles határú, tömör, vörös gomb alakjában látjuk a leülepedett vörösvértesteket, t, +, -H-, +++, ++++ pozitívitás esetén a vörösvértestek többé-kevésbé, ill. teljesen szétterülnek. A savó titere az utolsó határozott pozitívitást mutató (+) hígítás. Hemagglutináció gátlás (HAG). A pozitív savók egy részével elvégeztük a HAG próbát. Á TSE antigén hígítási sorának minden egyes tagjához adimk l-l cseppet a vizsgálandó savó olyan hígításából, amely a teljes agglutináló titer (utolsó ++++ agglutináció) 2, ill. 4-szeresét tartalmazza. 1 órai 37°C-on történő inkubálás után cseppentjük be a szenzibilizált SRBC szuszpenziót, s újabb 1 órai állás után olvasható le az eredmény. A hígítási sor első tagjaiban észlelhető negatív eredmény értékelhető pozitív gátlásként, s titere az utolsó határozott gátlást mutató antigén hígítás. 3 0