Varga Máté - Szentpéteri József (szerk.): Két világ határán. Természet- és társadalomtudományi tanulmányok a 70 éves Költő László tiszteletére - A kaposvári Rippl-Rónai Múzeum közleményei 6. (Kaposvár, 2018)
Csapó János: Új módszer a fosszilis csontok korának meghatározására az aminosavak racemiációja alapján
44 CSAPÓ JÁNOS Ezt követően két módszert hasonlítottunk össze az a-aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására. Az első módszer szerint o-ftálaldehiddel (OPA) és az optikailag aktiv 2,3,4,6-tetra-0-acetil-1-tio-ßglükopiranoziddal történő származékképzés után fordított fázisú folyadékkromatográfiával határoztuk meg a D-aminosavakat. A származékképzés során a reakció szobahőmérsékleten, néhány perc alatt lejátszódik, és a kapott származékok igen stabilak. A képzett diasztereoizomerek szelektivitása - a lizin és az ornitin kivételével - különösen jónak mondható. A származékok fluoreszcenciás gerjesztési és emissziós maximuma 342 és 410 nm volt. A kimutathatóság határa fluoreszcens detektor esetén 2 pmol, elektrokémiai detektor esetén pedig 1 pmol volt az aminosavak többségére. Ezután kipróbáltuk az a-aminosav enantiomerek szétválasztására és meghatározására, valamint az iminosavak szelektív meghatározására az 1-(9-fluorenil)etil kloroformáttal történő származékképzés után kapott származékokat fordított fázisú kromatográfiával. Rendkívüli előnye az alkalmazott eljárásnak az, hogy a reagens mindkét enantiomerjének (+FLEC és -FLEC) használatával megnő a csúcsok azonosításának megbízhatósága, mivel a reagens másik enantiomerjével végezve el a származékképzést, megváltozik a diasztereomer származékok elúciós sorrendje. A D- és az L-hidroxiprolin cisz- és transz módosulatát a módszerrel tökéletesen el lehet választani egymástól. Mindkét módszer segítségével meghatároztuk a szabad aminosavak valamint a fehérjék racemizációját a folyadék- és gázfázisú hidrolízis során, valamint elvégeztük néhány ismert korú csontminta D- és L-aminosav tartalmának meghatározását. Miután kidolgoztuk az igen alacsony szintű racemizációt okozó fehérjehidrolízis módszerünket, hazánk különböző intézményeiből összegyűjtöttünk mintegy 100 darab fosszilis csontmintát, melyek korát korábban a Debreceni ATOMKI-ban radiokarbon módszerrel meghatározták. Meghatároztuk ezen minták D- és L-aminosav tartalmát származékképzés után fordított fázisú folyadékkromatográfiával. Ezt követően a D- és L-aminosav mennyiségéből meghatároztuk a D/L arányokat, melyeket ábrázolva az idő függvényében un. kalibrációs görbéket szerkesztettünk. Ezután a kalibrációs görbéket használtuk ismeretlen csontminta korának meghatározására, miután meghatároztuk annak D- és L-aminosav tartalmát. Mivel az aminosavak racemizációját nemcsak az élő szervezet halála után eltelt idő, hanem a talaj hőmérséklete, pFI-ja, nyomelemtartalma és egyéb más körülmények is befolyásolják, a radiokarbon keltezésre, mint abszolút módszerre történő kalibrálással a környezet okozta racemizációs hibákat ki tudtuk küszöbölni. A D- és az L-aminosavak analízise után kitűnt, hogy a kormeghatározásra leginkább az alábbi aminosavak alkalmasak, mert egyrészt nagyobb mennyiségben fordulnak elő még a 100.000 évnél idősebb csontokban is, másrészt pedig viszonylag könnyű őket HPLC-vel meghatározni: hisztidin, fenilalanin, aszparaginsav, glutaminsav, alanin, izoleucin és valin. Vizsgálataink során meghatároztuk ezen aminosavak racemizációs felezési idejét, és ettől függően a kormeghatározás szempontjából az aminosavakat különböző csoportokba tudtuk osztani. A hisztidin a fenilalanin és az aszparaginsav alkalmas az ún. fiatalabb minták korának becslésére (2-35.000 év), a glutaminsav és az alanin a 10-80.000 év közötti mintákra, míg az izoleucinnal és a valinnal a 30.000-450.000 év közötti minták kora becsülhető. Elemeztük a kidolgozott módszer pontosságát is. Megállapítottuk, hogy 6-10.000 év közötti mintáknál egy aminosav használata esetén a módszer pontossága ±500-600 év, több aminosav használata esetén pedig ±200-300 év.
