Varga Máté - Szentpéteri József (szerk.): Két világ határán. Természet- és társadalomtudományi tanulmányok a 70 éves Költő László tiszteletére - A kaposvári Rippl-Rónai Múzeum közleményei 6. (Kaposvár, 2018)
Csapó János: Új módszer a fosszilis csontok korának meghatározására az aminosavak racemiációja alapján
ÚJ MÓDSZER A FOSSZILIS CSONTOK KORÁNAK MEGHATÁROZÁSÁRA 39 AZ AMINOSAVAK RACEMIZÁCIÓJA ALAPJÁN- 48 óra alatt 110 °C-on 4M bárium-hidroxid hatására az összes aminosav (szabad vagy peptidláncban kötött) teljes mértékben racemizálódott. Bárium-hidroxidos fehérje hidrolízissel tehát a triptofán racemizációját nem lehet meghatározni.- A magas hőmérsékleten rövid ideig tartó hidrolízist (160 °C-on 60 és 90 perc, 170 °C-on 45-60 perc és 180 °C-on 30 perc) javasoljuk mindazoknak, akik nem akarnak enzimes hidrolízist alkalmazni, és szeretnék a fehérjeláncban bekövetkezett racemizáció mértékét meghatározni. Fehérjetartalmú régészeti leletek korának meghatározása az aminosavak racemizációja alapján Anyagok és módszerek A laboratóriumba beérkező csontmintából tisztítással és mosással távolíthatók el a föld, talaj és egyéb szennyeződések. Ezt követi a szobahőmérsékleten való szárítás, őrlés majd homogenizálás. A mintát 0,1 mólos sósavval szuszpendáljuk, és a fehérje bomlásából keletkezett aminosavakat kioldjuk a mintából. Szűrés után a szabad aminosav tartalmú frakciót hűtőszekrényben tároljuk, a fehérjét tartalmazó szűrési maradékot megszárítjuk, majd ismételten homogenizáljuk. A nyersfehérje tartalmat Kjel-Foss 16.200 típusú gyorsnitrogén elemzővel határozzuk meg, majd a fehérjét 6M sósavval hidrolizáljuk. A hidrolízis befejeztével a sósavat liofilezéssel eltávolítjuk a mintából, majd a vizes feloldás során kivált szilikátokat centrifugálással választjuk el a szabad aminosav tartalmú folyadéktól. Az oldat pH-ját tömény nátrium-hidroxiddal pH=9-re állítjuk be, majd a kivált kalcium és magnézium valamint nehézfémsó-hidroxidokat szűréssel vagy ismételt centrifugálással különítjük el a szabad aminosavaktól. A hidroxidok eltávolítása után a pH-t azonnal 6 és 7 közé állítjuk be, majd az így kapott oldatot szárazra pároljuk liofilezéssel. A kapott anyag már készen áll a D- és L-aminosavak, valamint az izoleucin és a D-allo-izoleucin meghatározására. Az izoleucin és a D-allo-izoleucin meghatározása LKB-4101 -es típusú automatikus aminosav analizátorral történt. Az aminosavak D- és L-változatainak meghatározása történhet nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiával és ioncserés oszlopkromatográfiával diasztereomer dipeptid formában. Kísérleteink kezdetekor az általunk kidolgozott ioncserés oszlopkromatográfiás módszert alkalmaztuk a D- és L-aminosavak diasztereomer dipeptid alakban történő elválasztására. E módszerrel a D- és L-aminosavak szétválasztása és meghatározása az alábbi lépéseket tartalmazza:-a minta előkészítése;-a mintában lévő fehérje sósavas hidrolízise;-az aminosavak szétválasztása ioncserés oszlopkromatográfiával;-a diasztereomer dipeptidek szintézise;-a diasztereomer dipeptidek szétválasztása és meghatározása. A módszer leglényegesebb pontja a diasztereomer dipeptidek szintézise és szétválasztása. A védőcsoport (tercier-butil-oxi-karbonil-csoport, BOC) és az aktív észter, (N-hidroxi-szukcinimid, ONSU) kiválasztása után annak eldöntése következett, hogy melyik legyen az acilező aminosav a rendelkezésre álló fehérjeépítő aminosavak közül. Mivel szükségszerű, hogy az acilező aminosav aszimmetria centrummal rendelkezzen, valamint a kapcsolás a lehető legrövidebb időt vegye igénybe, a választás az alaninra (Alá) esett. Szintetizáltuk a tercier-butil-oxi-karbonil-L-alanin-N-hidroxi-szukcinimid aktív észtert, mely segítségével alanil diasztereomer dipeptideket hoztunk létre. A dipeptidek szétválasztására végzett kísérletekből kiderült, hogy azok még az aszparaginsav esetében is az Alá után jelennek meg a kromatogrammon, tehát az elválasztás legalább 1-1,5 órát vesz igénybe. Fentiek miatt szintetizáltuk a bis-tercier-butil-oxi-karbonil-L-cisztin-bis-N-hidroxi-szukcinimid észtert remélve azt, hogy az ezzel létrehozott 2-szulfonsav alanil diasztereomer dipeptideket a semleges, illetve bázikus aminosavaknál gyorsabban lehet meghatározni. Az aktív észterek szintézise után kristályos aminosavakból, illetve az aminosav analizátoron elválasztott egyes aminosavakból előállítottuk a diasztereomer dipeptideket, majd szétválasztottuk őket az LKB-4101-es típusú automatikus aminosav analizátorral. Mindkét diasztereomer dipeptid formában történő elválasztási módszer alkalmas a legalább 1%-ban jelenlévő D- (vagy L) aminosav kimutatására a 99%-ban jelen lévő L- (vagy D) aminosav mellett. 1992-1993-ban a göteborgi Chalmers University Analytical and Marine Chemistry tanszékén folytattuk vizsgálatainkat, és határoztuk meg különböző fehérjetartalmú régészeti leletek D- és L-aminosav tartalmát nagyhatékonyságú folyadékkromatográffal. Ugyanez az intézet 1994-1995-re rendelkezésünkre bocsájtott egy folyadékkromatográfot, mellyel elkezdett vizsgálatainkat be tudtuk fejezni. Természetesen összehasonlító vizsgálatokat végeztünk az ioncserés oszlopkromatográfiás és a nagyhatékonyságú folyadékkromatográfiás módszer között. Három különböző korú csontminta esetében (a kort radiokarbon módszerrel határozták meg) kapott vizsgálataink eredményeit az 5. táblázat tartalmazza. A táblázat adataiból látható, hogy a két módszer között az azonosság megfelelő, tehát a két módszerrel kapott eredményeket együtt lehet értékelni a csont korának meghatározására létrehozott hitelesítő görbék szerkesztésekor. Mivel a HPLC módszer sokkal könnyebben kivitelezhető, mint az lEC-s, ezért amennyiben egy
