Lanszki József - Ábrahám Levente (szerk.): Vadon élő vidrák Magyarországon - Natura Somogyiensis 14. (Kaposvár, 2009)

3. VIDRAPOPULÁCIÓK: GENETIKAI MINTÁZAT, SŰRŰSÉG ÉS MONITOROZÁS - 3.3. Molekuláris genetikai vizsgálat módszere

A hullaték mintából a teljes genomikus DNS izolálást (kivonás, elkülönítés) COXON et al. (1998), DALLAS et al. (1998, 1999, 2003) módszere szerint történt CTAB/GITC feltárással és kovaföldes DNS-kötéssel. A módszerben több módosítást tettünk. A teljes izolálás munka és költségigénye miatt beiktattunk egy ellenőrzést, amely során a hullaték minta lizátumát vizsgáltuk meg 2%-os agaróz gélen (ethidium-bromid festéssel) történő rövid futtatással, hogy egyáltalán tartalmaz-e DNS-t (83. ábra). Megfigyeléseink szerint az itt DNS-t nem mutató minták további feldolgozása már értelmetlen, mivel PCR amplifikáció (felsokszorozódás) nem várható. Azonban az itt megfigyelhető DNS sem feltétlenül biztosíték a genotipizálás lehetőségére, mert gyakran, feltehetően igen nagy mennyiségű táplálék DNS-t hordoz, ami nagyon felhígítja a vidra DNS-t vagy éppen akadályozza is annak amplifikációját. A kovaföldes DNS-kötés után az eredeti drága, szűréses elválasztás helyett centrifugálást, majd desztillált vízben átmosást alkalmaztunk. A kivont DNS-t végül vízben (MilliQ) tároltuk -20 °C-on. A fagyasztott szövetmintákból a genomikus DNS-t a szokványos proteináz-kináz enzimmel történő emésztést és kisózást követően csaptuk ki etanollal (MILLER et al. 1988). A DNS csapadékot TE pufferben oldottuk fel és koncentrációmérést követően 100 ng/jil töménységűre egalizáltuk a mintákat. 83. ábra: Genomikus DNS (fekete nyíl) detektálása agaróz gélen a különböző ürülékminták lizátumaiból Mikroszatellit lókuszok PCR-es amplifikálása A vidra mikroszatellit lókuszok amplifikációját Dallas és Piertney (1998) e célra kialakított és optimalizált kilenc primerpárjával végeztük, amelyek: Lut-435, Lut-604, Lut615, Lut-701, Lut-715, Lut-717, Lut-733, Lut-832 és Lut-833 (4. melléklet). Ezeket tesztelték a lehetséges táplálékállatokra is, amelyek esetleg a hul latékminták genotipizálása során bezavarhatnának. A Lut-SRY primerpárt használtuk ivarhatározásra (DALLAS et al. 2000). Az annealing (kapcsolódási, tapadási) hőmérséklet vagy 60 °C (Lut-615, Lut833, Lut-701, Lut-715, Lut-717, Lut-733) vagy 58 °C volt (Lut-435, Lut-604, Lut-832). Duplex PCR-t alkalmaztunk az ivar meghatározáshoz, ahol a Lut-SRY-t Lut-701 vagy Lut-615 primerekkel kombináltuk (annealing hőmérséklet: 60 °C). Az amplifikációt 15 pl PCR elegyben végeztük el Dynazyme (Finnzyme) polimeráz alkalmazásával (részletesebben: LANSZKI et al. 2008). PCR-termékek ellenőrzése agaróz elektroforézissel A PCR amplifikációt követően a termékeket agaróz elektroforézissel ellenőriztük, ennek során állapítottuk meg a hígítási igényt. Az agarózon mutatott kép alapján a termékeket nem vagy 5-10-szeresére hígítottuk, hogy a leolvasás zavartalan és pontos legyen (84. ábra).