Hadak Útján. A népvándorlás kor fiatal kutatóinak konferenciája (Szeged, 2000)

Csapó János - Csapó-Kiss Zsuzsanna - Csapó János jun.: Mira használható az aminosavanalitika a régészetben?

CSAPÓ János - CSAPÓ-KISS Zsuzsanna - CSAPÓ János jun.

FEHÉRJETARTALMÚ RÉGÉSZETI LELETEK KORÁNAK MÉGHA TÁROZÁSA AZAMINOSA VAK RACEM1ZÁCIÓJA ALAPJÁN

Anyagok és módszerek

A laboratóriumba beérkező csontmintából tisztítással és mosással távolíthatók el a föld, talaj és egyéb szennyeződések. Ezt követi a szobahőmérsékleten való szárítás, őrlés majd homogenizálás. A mintát 0,1 mólos sósavval szuszpendáljuk és a fehérje bomlásából keletkezett aminosavakat kioldjuk a mintából. Szűrés után a szabad aminosav tartalmú frakciót hűtőszekrényben tároljuk, a fehérjét tartalmazó szűrési maradékot megszárítjuk, majd ismételten homogenizáljuk. A nyersfehérje tartalmat Kjel-Foss 16,200 típusú gyorsnitrogén elemzővel határozzuk meg, majd hidrolizáljuk. A hidrolízis befejeztével a sósavat liofdezéssel eltávolítjuk a mintából, majd a vizes feloldás során kivált sziliká- tokat centrifugálással választjuk el a szabad aminosav tartalmú folyadéktól. Az oldat pH-ját tömény nátrium-hidroxiddal pH=9-re állítjuk be, majd a kivált kálcium és magnézium valamint nehézfém- só-hidroxidokat szűréssel vagy ismételt centrifugálással különítjük el a szabad aminosavaktól. A hidroxidok eltávolítása után a pH-t azonnal 6 és 7 közé állítjuk be, majd az így kapott oldatot szárazra pároljuk liofdezéssel. A kapott anyag már készen áll a D- és L-aminosavak, valamint az izoleucin és a D-allo-izoleucin meghatározására. Az izoleucin és a D-allo-izoleucin meghatározása LKB-4101-es típusú automatikus aminosavanalizá- torral történt.

Az aminosavak D- és L-változatainak meghatározása történhet nagyhatékonyságú folyadékkro- matográfiával és ioncserés oszlopkromatográfiával diasztereomer dipeptid formában. A PATE Állattenyésztési Karának laboratóriumi lehetőségeit figyelembe véve kísérleteink kezdetekor az általunk kidolgozott ioncserés oszlopkromatográfiás módszert alkalmaztuk a D- és L-aminosavak diasztereomer dipeptid alakban történő elválasztására. E módszerrel a D- és L-aminosavak szétválasztása és meghatározása az alábbi lépéseket tartalmazza:

a minta előkészítése;

a mintában lévő fehérje sósavas hidrolízise;

az aminosavak szétválasztása ioncserés oszlopkromatográfiával;

a diasztereomer dipeptidek szintézise;

a diasztereomer dipeptidek szétválasztása és meghatározása;

A módszer leglényegesebb pontja a diasztereomer dipeptidek szintézise és szétválasztása. A védőcsoport (tercier-butil-oxi-karbonil-csoport, BOC) és az aktív észter (N-hidroxi-szukcinimid, ONSU) kiválasztása után annak eldöntése következett, hogy melyik legyen az acilező aminosav a rendelkezésre álló fehérjeépítő aminosavak közül. Mivel szükségszerű, hogy az acilező aminosav aszimmetriacentrummal rendelkezzen, valamint a kapcsolás a lehető legrövidebb időt vegye igénybe, a választás az alaninra (Alá) esett. Szintetizáltuk a tercier-butil-oxi-karbo- nil-L-alanin-N-hidroxi-szukcinimid aktív észtert, mely segítségével alanil diasztereomer dipeptideket hoztunk létre. A dipeptidek szétválasztására végzett kísérletekből kiderült, hogy azok még az aszpara- ginsav esetében is az Alá után jelennek meg a kromatogrammon, tehát az elválasztás legalább 1-1,5 órát vesz igénybe.

Fentiek miatt szintetizáltuk a bis-tercier-butil- oxi-karbonil-L-cisztin-bis-N-hidroxi-szukcinimid észtert, remélve azt, hogy az ezzel szintetizált 2-szulfonsav alanil diasztereomer dipeptideket a semleges, illetve bázikus aminosavaknál gyorsabban lehet meghatározni. Az aktív észterek szintézise után kristályos aminosavakból, illetve az aminosavanalizátoron elválasztott egyes aminosavakból előállítottuk a diasztereomer dipeptideket, majd szétválasztottuk őket az LKB-4101-es típusú automatikus aminosavanalizátorral. Mindkét diasztereomer dipeptid formában történő elválasztási módszer alkalmas a legalább 1%-ban jelenlévő D- (vagy L) aminosav kimutatására a 99%-ban szereplő L- (vagy D) aminosav mellett.

1992-1993-ban, a göteborgi Chalmers University Analytical and Marine Chemistry tanszékén folytattuk vizsgálatainkat, és határoztuk meg kürozására kidolgozott módszerekről beszámoljunk. Nincs mód arra sem, hogy ismertessük az általunk kidolgozott minimális racemizációvaljáró, rövid ideig, magas hőmérsékleten végzett fehérjehidrolízissel kapott eredményeinket, melyek különösen hasznosíthatók régészeti leletek D- és L-aminosavainak meghatározására. Amennyiben ez a téma felkelti a Tisztelt Olvasó érdeklődését, szívesen elküldjük az e helyre szánt mintegy 14 oldalas irodalmi összefoglalót és a hozzá tartozó mintegy 90-100 db irodalmi hivatkozást. Célunk e cikk megírásával az is volt, hogy felhívjuk régészkollégáinkfigyelmét az általunk kidolgozott módszerekre, bátorítva őket az együttműködésre.

442