Hidrológiai Közlöny, 2017 (97. évfolyam)
2017 / Különszám - SZAKCIKKEK - Márton Zsuzsanna, Szabó Attila, Boros Emil, Vörös Lajos és Felföldi Tamás: Az észak-kazahsztáni sós tavak ismeretlen prokarióta közösségei
16 Hidrológiai Közlöny 2017. 97. évf. különszám módszerek szerint végeztük. Molekuláris biológiai vizsgálatok céljára a tavak vizének felső rétegéből 100-200 ml-t 0,22 pm-es fecskendőszűrőn (Merck Millipore) szűrtünk át. A DNS kivonást a szűrőpapírból Power Soil DNA Isolation Kit-tel (MoBio Laboratories) végeztük a gyártó utasításainak megfelelően, azzal a különbséggel, hogy a sejtek feltárása sejtmalommal (Retsch) történt 30 Hz-en 2 percen keresztül. A taxonómiai azonosításhoz a 16S rRNS molekuláris markergént szaporítottuk fel polimeráz láncreakció segítségével három párhuzamos reakcióban. A reakcióelegy összetétele a következő volt 20 pl térfogatban: 4 pl 5x Phusion HF Buffer (Thermo Fisher Scientific), 0,2 mM dNTP (Fermentas), 0,4 pg/pL BSA (Fermentas), 0,02 U/pL Phusion High Fidelity DNS polimeráz enzim (Thermo Fischer), 0,5 pM S-D-Bact-0341-b-S-17 és 0,5 pM S-D-Bact-0785-a-A21 primer (Bacteria-specifikus reakció), illetve 0,5 pM S-D-Arch-0519-a-S-15 és 0,5 pM S-D-Arch-1041-a-A-18 primer (Archaea-specifikus reakció) (Klindworth és társai 2013) és lpl DNS. A pri- mereket előzetesen egyedi mintaazonosítóval és a szekvenáló platformnak megfelelő adapterekkel láttuk el. A reakció hőprofilja a következő volt: kezdeti denaturáció 98 °C 5 perc; 28 ciklus: denaturáció 95 °C 40 másodperc, anneláció 55 °C 2 perc és extenzió 72 °C 1 perc; végső extenzió 72 °C 10 perc. A párhuzamos PCR termékeket egyesítettük, majd High Pure PCR Cleanup Micro Kit (Roche) segítségével tisztítottuk. Koncentrációjuk meghatározása és tisztaságuk ellenőrzése Agilent Fligh Sensitivity DNA Kit-tel történt 2100 Bioanalyzer készüléken (Agilent Technologies). Az egyedi DNS molekulák bázissorrendjének meghatározását GS Junior (Roche) készüléken végeztük a gyártó utasításainak megfelelően. A nyers DNS szekvencia adatok feldolgozását a mothur vl.35 szoftverrel (Schloss és társai 2009), a szekvenciák illesztését a SINA programmal (Pruesse és társai 2012), a taxonok azonosítását pedig az ARB-SILVA referencia adatbázis (Quast és társai 2013) alapján végeztük. Ezt követően OTU-kat („operational taxonomic unit”, azaz operatív taxonómiai egység) hoztunk létre a bakteriális faj szám becslésnél javasolt 97%-os hasonlósági értéknél (Tindall és társai 2010), ezek szolgáltak a további statisztikai elemzések alapjául. A tavak Bacteria és Archaea taxonjainak arányát realtime PCR-rel határoztuk meg, Taqman próbák használatával. A reakcióelegy összetétele a következő volt 16 pl térfogatban: 2x Taqman Gene Expression Mastermix (Applied Biosystems), 20x Assay: BACT1369F, PROK1492R, TM1389F (Suzuki és társai 2000), illetve Arch349F, Arch806Rá? Arch516F (Takai és Horikoshi 2000) és lpl DNS. A reakció hőprofilja a következő volt: 50 °C 2 perc, 95 °C 10 perc; 40 ciklus: 95 °C 15 másodperc, 56 °C (Bacteria), illetve 59 °C (Archaea) 1 perc. A reakciókat StepOnePlus Real-Time PCR (Thermo Fisher Scientific) készüléken végeztük. 1. táblázat. A vizsgált észak-kazahsztáni sós tavak limnológiai Table 1. Limnological characteristics of the studied saline lakes of Northern Kazakhstan Tó neve Vízmélység (cm) pH Sótartalom (g/L) Teljes foszfortartalom (Pg/L) Klorofill-a (Pg/L) Nitrát tartalom (Pg/L) Kis Aksuat 50 8,36 3,0 249 53,4 123 Tengiz 70 8,89 11,2 351 377,6 39 K10 70 8,57 24,4 95 8,53 72 K15 20 9,46 74,7 49 5,97 57 K6 10 8,14 176 309 9,70 300 Urkash 10 7,45 261 26 6,50 15 EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A mintavételkor mért és később laboratóriumban meghatározott fizikai-kémiai jellemzőket az 1. táblázat tartalmazza. Összesen tizenhat tó vizét vizsgáltuk, a tavak trofikus állapota és szalinitása széles skálán mozgott, jelentős részük hipertróf és hiperszalin jelleget mutatott. Ezek közül hat tó bakteriális közösségének összetételét tártuk fel részletesen. A tavak többségében a Bacteria dómén volt meghatározó (/. ábra). Azonban a K6 jelzésű tó és az Urkash tó esetében az Archaea dómén tagjai legalább kétszeres mennyiségben voltak jelen, mindez jól összevethető a fizikai-kémiai paraméterekkel, mivel a vizsgált tavak között a sótartalom ezekben volt a legmagasabb. A Kulunda sztyeppén (Altaj-hegyvidék, Oroszország) négy hiperszalin tavon végzett vizsgálatok alapján Vavourakis és munkatársai megállapították, hogy a sókoncentrációnak meghatározó szerepe van a prokarióta közösség szerkezetére. 250 g/L sókoncentráció esetében a bakteriális fajgazdagság jelentősen csökken és a Halobacteria genus képviselői válnak dominánssá. Efeletti sókoncentrációnál pedig már az Archaea dómén tagjai voltak jelen nagyobb számban (Vavourakis és társai 2016). Mindez alátámasztja az általunk kapott eredményeket. Lábra: A Bacteria és Archaea domének relatív mennyisége Figure 1.: Relative abundance of domains Bacteria and Archaea
