Hidrológiai Közlöny, 2016 (96. évfolyam)

2016 / Különszám - Zrínyi Zita, Linwen Zhang, Maász Gábor, Vértes Ákos, Elekes Károly, Pirger Zsolt: Progesztogének hatása a nagy mocsári csiga szaporodására és embrionális fejlődésére

104

Hidrológiai Közlöny 2016. 96. évf. különszám

szülőktől származó tojások minőségét (a szikanyag metabolomikai összetételét) és az embrionális sejtosztódás dinamikáját a fejlődés korai (2, 4 és 8 sejtes) szakaszában.

ANYAGOK ÉS MÓDSZEREK

Kezelés

A kezelést 10 ng/L progeszteron, levonorgeszter, drospirenon és gesztoden (Sigma Aldrich) keverékével végeztük 21 napon keresztül, háromszor ismételt párhuzamos elrendezésben 2015 februárja és augusztusa között Lymnaea modellállaton.

Spermium szám meghatározás

A spermium számot 10 napra elkülönített kontroll, vagy kezelt állatok ondó vezetékéből (Nakadera és társai 2014) határoztuk meg Partéé CyFlow ML áramlási citométerrel, Partéé FloMax® FCM Data Acquisition and Analysis szoftvert használva, MitoTracker® Deep Red FM és Hoechst 33342 (Life Technologies, CA, USA) festékekkel való jelölés után. A megadott paraméterekkel történő sejtszámlálás után konfokális mikroszkóp technikával ellenőriztük a kapott felhő sejttartalmát.

Az embrió korai fejlődésének vizsgálata

Az átlagosan 1 mm hosszanti átmérőjű tojás embrióból és az azt körülvevő szikanyagból (0,5-0,7 pL) áll. Az embrió fejlődés-követése a peterakástól számított 5 órán keresztül Leica M205 c sztereomikroszkóppal történt time-lapse szoftver alkalmazásával. Az első sejtosztódások (2, 4 és 8 sejt) idejének hosszát határoztuk meg, kezdőpontként a két sejtes zigóta állapotot alapul véve.

A tojás szikanyagának vizsgálata

Az embriót körül vevő szikanyagot peterakás utáni egy órán belül és a kikelés felénél, 96 óránál vizsgáltuk. A mintavételi technika lehetővé tette a tojások egyedi vizsgálatát, a tömegspektrometriás mérés pedig a metabolomikai minőségelemzést. Kapilláris mikro- mintavételt követően Nano-Offline ESI-AmaZon SL tömegspektrométerrel (Bruker Daltonik Gmbh) vagy Synapt G2 ionmobilitás tömegspektrométerrel térképeztük fel a metabolomikai profilt, MS2 tömeggel azonosítva a molekulákat (Zhang és társai 2014). Minőségindikátorként az adenilát energiahordozó molekulák arányát (AEC: ATP, ADP, AMP) és NADH/NAD arányt használtunk energia-állapot és reduktiv-oxidativ (redox.) státusz leírására. A statisztikai elemzést IBM SPSS Statistics 20 szoftverrel végeztük.

Energia töltés (AEC)

ATP + 0.5 ADP ATP + ADP+AMP

NADH + H

Redox, státusz = -------------—

NAD+

tonként) a kontroll csoporthoz képest (73,0±5,3 db állatonként). A harmadik hétre a kontroll nem változott jelentősen (63,9-6,4 db állatonként), a kezelt csoport viszont a csökkenő állatszám ellenére több, mint dupla annyi petét rakott állatonként (148,0±5,1 db). A spermium szám meghatározás eredménye szerint a 10 ng/L kezelt állatok szignifikánsan alacsonyabb (p<0,05; n=ll) spermium számot (1,2

x106±96 028 db) mutattak a kontrolihoz képest (1,5x106±113 176 db) (7. ábra). A kezelt szülőktől származó embriók a korai szakaszban gyorsabb osztódást mutattak (2. ábra), habár mindkét csoport embriói átlagosan 10±1 nap alatt keltek ki a tojásból. Az embriók fejlődését a zigóta állapottól regisztráltuk, az első sejtosztódástól (2 sejtes állapot, 0 perc - alsó kép) a második sejt- osztódáson át (4 sejtes állapot, 130±12 perc - középső kép) követtük a harmadik osztódásig (8 sejtes állapot, 111±4 perc - felső kép). A kontroll csoportban eltelt idő összesen 241±15 perc (n=6). A 10 ng/L kezelt csoport állataitól származó zigótákban a második osztódásig 115±7 perc, míg a harmadikig 106±5 perc telt el, összesen 222±4 perc (n=5).

f

Kontrol 10 ng/L

1. ábra. A spermium szám változása progesztogén kezelés hatására

Figure 1. Progestogen induced reduction in sperm number

2. ábra. A hormonkezelés hatása az embrionális fejlődés korai fázisaiban

Figure 2. The effect of progestogen treatment during the early embryonic development

1,8

1,6

To

2 1-4 x-a 1,2 2

E i

M

"• 0,8 E

.2 0,6

V 0,4 a.

i/i

0,2

EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK

A felnőtt állatoknál a 10 ng/L kezelt csoportban szignifikánsan magasabb mortalitás (~50%, n=20, p<0,05) volt megfigyelhető. A kezelt csoportban az állatok az első héten átlagosan kevesebb petét raktak (37,2±7,2 db állaA 3. ábra mutatja a tojás kormeghatározását és a mintavételi technikát, valamint, egy reprezentatív tömegspektrumot a vizsgált molekulákkal. A kontroll és a 10 ng/L kezelt szülőktől származó tojások szikanyaga közt, valamint az 1 és 96 órás tojások szikanyaga közt kvalita-