Hidrológiai Közlöny, 2016 (96. évfolyam)
2016 / Különszám - Anda Dóra, Makk Judit, Krett Gergely, Márialigeti Károly, Mádl-Szőnyi Judit, Borsodi Andrea: A Molnár János-barlang víz és biofilm bekteriumközösségei
4 Hidrológiai Közlöny 2016. 96. évf. különszám Jelen vizsgálatunk elsődleges célja az volt, hogy információt szerezzünk a Molnár János-barlangban fellelhető kétféle színű biofílm és a termálvíz baktériumközösségének szerkezetéről. Mivel ez a barlang a Rózsadomb sűrűn lakott területén, a felszín alatt kis mélységben húzódik, arra is kíváncsiak voltunk, hogy a közvetlen beszivárgásból adódó antropogén hatások mennyire jelennek meg a barlang vizében. A baktériumközösségek összetételének minél teljesebb körű feltárása érdekében egymással párhuzamosan alkalmaztunk tenyésztésen alapuló és molekuláris biológiai módszereket. ANYAG ÉS MÓDSZER Az összehasonlító mikrobiológiai vizsgálatokhoz a mintavételre 2012 decemberében került sor a Molnár János- barlang falán a vízszintnél képződött barna (MJBB), illetve fekete színű biofilmből (MJBF) és a barlangot szinte teljesen kitöltő termálvízből (MJV). A mintavételre a barlangban dolgozó búvárok közreműködésével került sor. A baktériumközösségek filogenetikai diverzitását tenyésztésen alapuló és tenyésztéstől független molekuláris klónozás módszerekkel vizsgáltuk. A tenyésztéshez szerves tápanyagban szegény, R2A (DSM 830) és Sphaerotilus-Leptothrix vasszulfát-tartalmú (DSM 803) táptalajokat használtunk. A kék-fehér szelekción alapuló molekuláris klónozást a Borsodi és társai (2012) által korábban is alkalmazott módszer szerint végeztük. EREDMÉNYEK ÉS ÉRTÉKELÉSÜK A Molnár János-barlangból gyűjtött biofilm és vízminták mikrobiológiai vizsgálata során a kétféle táptalaj felhasználásával 66 baktériumtörzset izoláltunk. A baktérium- törzseket a 16S rRNS gén bázissorrend elemzése alapján a Proteobacteria, a Firmicutes és az Actinobacteria törzsek képviselőiként azonosítottuk. A vasszulfát-tartalmú táptalajon 9, míg az R2A táptalajon 8 nemzetség képviselőit sikerült tenyésztésbe vonni. A barna biofilm minta (MJBB) tenyésztésen alapuló közösségszerkezeti vizsgálatával az Aeromonas nemzetség képviselői is előkerültek, kizárólag a szerves tápanyagban szegény R2A táptalajról (1. táblázat). Az Aeromonasok előfordulása gyakori a hazai édesvizekben (Langó és társai 2002), de a spanyolországi Altamira-barlang beszivárgó vizének Gram- negatív szervezetei között szintén az Aeromonas nemzetség nagyarányú jelenlétét mutatatták ki (Laiz és társai 1999). A vízminta esetében a Raoultella, az Enterobacter és a Citrobacter nemzetségek képviselőit mindkét táptalajról tenyésztésbe vontuk (1. táblázat). Ezeknek az indikátor szervezeteknek a barlangvízben való jelenléte egyértelműen emberi tevékenység nyomára utal. A termálvízzel kitöltött barlang vizét - numerikus szimulációval bizonyítottan - mélységi eredetű karszt és medence- fluidumok táplálják (Mádl-Szőnyi és Tóth 2015). Ugyanakkor a szennyvízhálózatból történő beszivárgás szerepe sem zárható ki a lakott terület alatt fekvő budai barlangokban ( Virág és társai 2010, Bergmann és társai 2011). A Budai Termálkarszt déli rendszeréhez tartozó Gel- lért-Rudas-Rác fürdők négy forráscsoportja (DianaHygieia-forrás, Rudas fürdő Török-forrás, Gellért fürdő Ősforrás, Rác fürdő Nagyforrás) vizéből és biofilm mintáiból ugyanezen táptalajok alkalmazásával korábban már végeztünk tenyésztésen alapuló vizsgálatokat, melynek célja a források környékén megtelepedő baktériumközösségek feltárása volt (Borsodi és társai 2012, Anda és társai 2014). Az eddigi eredmények alapján elmondható, hogy csak a Molnár János-barlangból kitenyésztett baktériumtörzsek között azonosítottuk a Gammaproteobacteria osztály Enterobacteriaceae családjának képviselőit, ami megerősíti ezeknek a mikroorganizmusoknak a felszíni, feltehetően szennyvízcsatorna szivárgásból való eredetét. A fakultatív anaerob, Gram-negatív, endospórát nem képező, pálcika alakú sejtekkel rendelkező Enterobacteriaceae család tagjainak a képviselőit a Szlo- vák-karszt barlangjaiból is kimutatták. A szennyezettséget ott a mezőgazdasági tevékenységgel hozták összefüggésbe (Sémán és társai 2015). 1. táblázat. A Molnár János-barlangból származó víz és barna biofilm mintákból azonosított baktériumtörzsek (R = R2A, V = Vasszulfát-tartalmú táptalaj) Table 1. Cultivated strains from the reddish-brown biofilm and water of Molnár János Cave (R = R2A medium, V = ferrous- sulphate medium) Filogenetikai csoportok Minta származása Táptalaj R V Alphaproteobacteria Brevundimonas bullata (D12785) víz + Caulobacter henricii (AJ227758) barna bio Film + Paracoccus yeei (AY014173) víz + Betaproteobacteria Xylophilus ampelinus (AF078758) barna biofilm + Variovorax boronicumulans (AB30051 barna biofílm + Vogesella alkaliphila (HE819389) barna biofílm + Gammaproteobacteria Aeromonas ichthiosmia (X71120) barna biofílm + Aeromonas veronii (X60414) barna biofílm + Citrobacterfreundii (ANAV01000046) barna biofílm + Citrobacteryoungae (AJ564736) víz + + Enterobacter ludwigii (AJ853891) víz + + Pantoea dispersa (DQ504305) barna biofílm + Raoultella terrigena (Y17658) víz + + Firmicutes Brevibacillusfluminis (EU375457) barna biofílm + Brevibacillus ginsengisoli (AB245376 barna biofílm + Actinobacteria Janibacter terrae (AF176948) barna biofílm + Micrococcusyunnanensis (FJ214355) barna biofílm + A Molnár János-barlang járat-rendszerében foltokban megtalálható barna (MJBB) és az kőzetfelszínén kialakult fekete színű (MJBF) biofilmekből, valamint a barlang vizéből (MJV) három, egyenként csaknem 200 tagú molekuláris klóntárat hoztunk létre. A vízmintából 3, a fekete biofilmből 6, míg a barna biofilm mintából 9 filogenetikai törzs képviselőinek jelenlétét mutattuk ki (1. ábra). A vízmintából létrehozott klóntárat (MJV) szinte kizárólag egy a Betaproteobacteria osztályba (96,7%) sorolható filotípus előfordulása jellemezte (1. ábra), mely a fakultatív kemolitoautotróf kén-oxidáló anyagcserével jellemezhető Thiobacillus aquesulis baktériumfajjal mu
