Hidrológiai Közlöny, 2015 (95. évfolyam)

2015 / 5-6. különszám - LVI. Hidrobiológus Napok előadásai

29

Bíborbaktérium-közösség összetételének megismerése új generációs DNS-szekvenálási és tenyésztéses technikák kombinálásával

Korponai Kristóf1, Somogyi Boglárka2, Szabó Attila1, Boros Emil2, Vörös Lajos2, Felföldi Tamás1 ^LTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117 Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. (

tamas.felfoldi@gmail.com

) 2MTA Ökológiai Kutatóközpont, Balatoni Limnológiai Intézet, 8237 Tihany, Klebelsberg Kuno út 3.

Kivonat: Egy Fülöpszállás határában található sekély szikes víztesten 2014 áprilisában látványos, kettős tömegprodukció volt megfigyelhető: a felső három cm-es vízrétegben található planktonikus zöldalgák (Oocystis submarina) tömege alatt jól elkülönülő réteget alkottak az ostorral rendelkező, pálcika alakú, fototaxist mutató bíborbaktériumok, amelyek azonosítását nagyfelbontású molekuláris módszerrel és tenyésztéssel is megkíséreltük. Az egyetlen vízmintából kivont közösségi DNS újgenerációs szekvenálással (Roche GS Junior platform) végzett elemzése során 3131 szekvenciát kaptunk, amelyeknek több, mint felét az Ectothiorhodospira és a Rhodobaca nemzetségek alkották. A domináns csoportok közül többet sikerült tenyésztésbe is vonnunk. A vízmintából háromfajta táptalajon végeztünk aerob és anaerob tenyésztést, amihez két saját fejlesztésű táptalajt is felhasználtunk. Aerob tenyésztés során 1,7-35 x 106 TKE/mL közötti baktérium csíraszámot kaptunk 19 nap inkubáció után, míg anaerob körülmények között nagyon különböző értékeket mértünk a különböző táptalajokon. Az izolált törzsek kb. fele pirosas színű volt, néhányuk irizálást is mutatott. A törzsek között a Proteobacteria és a Bacteroidetes phylumok tagjai domináltak, és a Halomonas, Pseudomonas, Nitrincola, Vibrio, Alkalimonas, Porphyrobacter, Loktanella, Paracoccus, Roseicitre- um, Roseinatronobacter, Rhodobaca, Belliella és Aquiflexum nemzetségekkel mutattak rokonságot. Több, a tudományra nézve új fajt izoláltunk, amelyek leírását a közeljövőben fogjuk elvégezni.

Kulcsszavak: szikes tó, bíborbaktérium, tömegprodukció, tenyésztés, újgenerációs DNS-szekvenálás.

Bevezetés

A szikes tavak a Kárpát-medence jellegzetes felszíni formái. Csak nagyon kevés hozzájuk hasonló kemizmu- sú vízteret találunk Földünkön (Boros és mtsai., 2014). Ezekre a sekély, kis fotikus zónával rendelkező, nyaranta gyakran kiszáradó tavakra jellemző a lúgos pH (9-11), a nagy napi hőingás és a relatíve magas sziksó-tartartalom is. Ezen tulajdonságok olyan erős szelekciós hatással bírnak az élőlényekre nézve, hogy a tavak életközösségét néhány kivételtől eltekintve egysejtű szervezetekre korlátozza (Sorokin és mtsai., 2004). A hazai szikesekben é- lő planktonikus közösség összetételére jellegzetes szezonális változások jellemzőek, amelyeknek gyakorta része a téli zöldalgavirágzás (Somogyi és mtsai., 2009; Pálffy és mtsai., 2014), amelyet a kárpát-medencei szikeseken kívül eddig csak Belső-Azsiában írtak le (Fanjing és mtsai., 2009). Szintén érdekes jelenség a tavasszal-nyáron nagy mértékben elszaporodó zöldalgákkal vagy pikocia- no-baktériumokkal együtt megjelenő bíborszínű baktériumok szemmel is jól látható tömege a felszíni zöld réteg alatt (Borsodi és mtsai., 2013). Utóbbi jelenség sós vízi környezetből régóta ismert (Ollivier és mtsai., 1994; Sorokin és mtsai., 2004).

Kutatásunk célja egy Fülöpszállás határában található szikes tóban megfigyelt bíborbaktérium tömegprodukció összetételének feltárása volt.

Anyag és módszer

A mintavétel 2014. április 23-án történt. A kisméretű, névtelen tó a Kelemen-szék közelében található a Kiskunsági Nemzeti Park területén (É. sz. 46°45,818’, K. h. 19° 10,828’). Az alapvető vízkémiai paramétereket a helyszínen mértük (WTW MultiLine P 8211 multiméterrel), míg az a-klorofill (Wellburn, 1994) és a-bakterio- klorofill koncentrációjának meghatározása (Castenholz, 1973; Biel, 1986) laboratóriumi körülmények között történt. A zöld vízoszlop és az üledék közvetlen közelében megfigyelt bíbor színű réteg elemzését külön végeztük, a baktériumközösség összetételének meghatározását csak ez utóbbi rétegből végeztük el.

A közösségi DNS-t 500 mL vízmintából vontuk ki UltraClean* Soil DNA Isolation Kit (MoBio) segítségével. A molekuláris vizsgálatokhoz a bakteriális riboszó- ma kis alegységében található 16S RNS-t kódoló gént (a

16S rDNS-t) használtuk fel a taxonok azonosításához. A piroszekvenáláshoz a 16S rDNS-t polimeráz láncreakció (PCR) segítségével, B341F és B785R primerekkel (Klin- dworth és mtsai., 2013) szaporítottuk fel, a PCR termékeket High Pure PCR Cleanup Micro Kit-tel (Roche) tisztítottuk meg. A minőségi ellenőrzést és a DNS koncentrációjának mérését Model 2100 Bioanalyzer (Agilent) készülékkel végeztük. A DNS-szekvenálás GS Junior (Roche) platformon történt a gyártó utasításai szerint. Ezt követően a kapott szekvenciákat mothur vl.33 szoftver (Schloss és mtsai., 2009) segítségével elemeztük. A PCR amplifikáció és a szekvenáló reakció során keletkezett műtermékeket (homopolimerek, kimérák) és az egyszer előforduló (singleton) szekvenciákat a bioinformatikai elemzés során kiszűrtük. Az így nyert jó minőségű a- dathalmazt a SINA szoftver (Pruesse és mtsai., 2012) segítségével illesztettük, a taxonómiai azonosítás az ARB- SILVA referencia adatbázis (letöltés ideje: 2014.10.07.; Quast és mtsai., 2013) használatával történt.

A tenyésztéses vizsgálatokhoz háromféle táptalajt használtunk. Szilárdítóanyag szerint elkülöníthetjük az a- gar-alapú R2A-t (DSMZ médium 830; pH 10), a gellán- gumi-alapú saját fejlesztésű ’C’-től (1 L szikes víz, 16 g gellángumi, 0,6 g MgS04 x 7H20 és 0,3 g CaCl2 x 2H20) és ’S’-től (1 L desztillált víz, 16 g gellángumi, 1 g élesztőkivonat, 0,6 g MgS04 x 7H20, 0,3 g CaCl2 x 2H20 és 10 g NaHC03; pH 10). A vízmintából készített hét tagú hígítási sor tagjait erre a háromféle táptalajra szélesztettük, majd aerob és anaerob módon inkubáltuk szobahőmérsékleten, szórt fénnyel megvilágított helyiségben. Az anaerob tenyésztés anaerob zacskóban gáz- fejlesztő tasak felhasználásával történt (Microbiology A- naerocult® A mini, Merck). A tisztított törzsekből G- spin™ Total DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology) segítségével vontuk ki a DNS-t, amelyből 27F (Lane, 1991) és 1492R (Polz és Cavanaugh, 1998) primerek segítségével PCR-rel szaporítottuk fel a 16S rDNS-t. A termékek ellenőrzését 20 perces elektroforézissel végeztük 100 V-on 1%-os agaróz gélben. A PCR termékek tisztítását, a szekvenáló reakciót és a kapilláris elektroforézist az LGC Genomics végezte (Berlin, Németország), a Sanger-féle bázissorrend-meghatározás ABI 3730XL platformon (Applied Biosystems) történt. A kromatogra-