Hidrológiai Közlöny, 2014 (94. évfolyam)
2014 / 5-6. különszám - LV. Hidrobiológus Napok előadásai
104 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2014. 94. ÉVF. 5-6. SZ. Algatoxin-variabilitás vizsgálata egy eutróf víztérben Újvárosi Andrea Zsuzsanna Debreceni Egyetem, TTK, Növénytani Tanszék, 4032. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: Kulcsszavak: A hazai eutróf vízterekben megjelenő cianobakteriális vízvirágzásokra jellemző olyan szekunder metabolitok termelése, a- mely a környezetük számára toxikusak lehetnek. Az általunk vizsgált víztér a Gyulán található Bárdos-tó, amelyet azért választottunk vizsgálatainkhoz, mert megfigyelhető az évről évre megjelenő cianobakteriális tömegprodukciók megjelenése. Vizsgálatainkat három év távlatában végeztük, melyek kiterjedtek a fajegyüttesek meghatározására, a toxikus metabolitok szerkezet meghatározására, a termelésért felelős génklaszterek vizsgálatára, valamint a toxin koncentrációk meghatározására, és a toxikusság kimutatására. cianobaktérium, vízvirágzás, Microcystis aeruginosa, mikrocisztin. Bevezetés A cianobakteriális vízvirágzások száma az utóbbi évtizedekben világszerte megnövekedett (Vasas és mtsai., 2010, 2012). A felszíni vizek eutrofizációja nagymértékben hozzájárult a cianobakteriális tömegprodukciók kialakulásához. Az édesvízi vízterekben előforduló vízvirágzásokat főleg prokarióta cianobaktériumok idézik elő (Kováts, 2011; Bácsi és mtsai.,2011; Szigeti és mtsai.,2010). A cianobaktériumok képesek olyan szekunder metabolitok termelésérére is, melyekkel környezetüknek árthatnak (Farkas és mtsai., 2014; Beyer és mtsai. 2012; Vasas és mtsai., 2010; Bácsi és mtsai., 2009; Máthé és mtsai., 2007). Ezeket a vegyületeket cianotoxinoknak nevezzük (Falconer és mtsai., 1999). Hazánkban nagyobb figyelmet akkor kaptak a cianobakteriális vízvirágzások, mikor 1991-ben a Velencei-tavon Microcystis aeruginosa által (Kós és mtsai., 1995) termelt mikrocisztinek e- gészséget károsító hatásait észlelték. Bizonyos szekunder metabolitokról leírták toxikus, illetve enzim- és növekedésgátló hatásukat (Mackintosh és mtsai, 1990). Magyarországon az algavirágzásokban jellemzően a Microcystis aeruginosa prokarióta cianobaktérium fordul elő, amely mikrocisztin termelésre képes. A mikrocisztin olyan toxikus szekunder metabolit, amelynek számos i- zoformája ismert, és ez a változatosság adja a toxikussá- gukban való eltérést(Vasas és mtsai., 2004, 2006; M- Hamvas és mtsai.; 2003). Munkánk során az Alföldön található Bárdos-tóban (Gyula) megjelenő cianobaktérium közösségeket vizsgáltuk három év távlatában. Erről a víztérről ugyanis tudhatjuk korábbi évek megfigyeléseiből, hogy a környezetileg kedvező feltételek mellett évről évre folyamatos a vízvirágzások megjelenése. Célunk volt a megjelenő fajegyüttesek azonosítása, az általuk termelt toxikus metabolitok szerkezetének, koncentrációjának, és toxikussá- gának meghatározása, valamint a toxin termeléséért felelős gének azonosítása. Anyag és módszer Mintavételeink helyszíne a Bárdos-tó volt Gyulán (terület: 3 ha; átlagos mélység 1,5-2 méter), minden egyes mintavétel alkalmával kb. 1-1,5 1-t vettünk a part menti rész vízfelszíni felső rétegéből. Ezek általában nyári és kora őszi időszakokban zajlottak. A fajok meghatározása jellegzetes morfológiai jegyek alapján történt fénymikroszkóp segítségével (Komárek and Anagnostidis, 1998) (7. táblázat). A vízmintákat centrifugáltuk (Beckman, 8000 rpm, 5 perc), majd liofilizáltuk (Christ Alpha 1-2 LD plus lyophilizer). A toxikus metabolitok meghatározásához MALDI- TOF MS módszert alkalmaztunk (Welker és mtsai., 2007), amelyhez 7,38 g liofilizált mintából Kós és mtsai. (1995) által leírt módszer szerint toxint tisztítottunk. A liofilizált frakciókból MALD1-TOF MS analízisre 4,8 mg-ot mértünk be. A tömegspektrometriás mérés, és az izoformák azonosítása a Welker és mtsai. (2007) által leírtak alapján történt. A DNS izolálása a liofilizált mintákból (10 mg mindegyik) fenolos-kloroformos feltárással történt (Bácsi és mtsai., 2011; Vasas és mtsai., 2010). A toxintermelésért felelős gének vizsgálata (Microcystis sp. specifikus és Planktothrix sp. specifikus génklaszter) PCR-ral, detektálásuk agaróz gélelektroforézissel (1 % agaróz gél, puffer: lOxTBE (pH=8) történt. A detektáláshoz agaróz gélre 10 pl-t vittünk fel a reakcióelegyből, a DNS marker- ből 1 pl-t (GeneRuler™ 100 bp DNA Ladder; Thermo Scientific). A festés 4 pl EtBr-dal, a dokumentálás Cleaver GelDoc System-mel történt. A mikrocisztin koncentráció meghatározásához ELISA (Enzo Life Science) kitet használtunk, a méréseket a megadott protokoll szerint végeztük (Fischer és mtsai., 2011). A mérésekhez a vizes kivonatokat 10 mg liofilizált mintából 500 pl bidesztillált víz hozzáadásával készítettük háromszori fagyasztás-dörzsöléssel, és 3x5 perc szonikálással. Majd 5 perc 13000 rpm centrifugálással a felülúszóból készítettünk 0,2 mg ml'1 koncentrációjú törzsoldatot. A törzsoldatból hígitási sort készítettünk: 40 pg ml'1; 4 pg ml'1; 0,4 pg ml1; 0,04 pg ml'1, amelyet felvittünk a reakcióhoz. A mérés 450 nm-en történt spektrofotometriásán ELISA Readerrel. A mustár csíranövényteszt a Kós és mtsai. (1995), és Vasas és mtsai. (2002) által leírt módszer alapján történt, amellyel a cianotoxin növekedésgátló hatását, s így a to- xikusságot vizsgáltuk. Eredmények és értékelésük A mintavételek során a fajokból és arányukból látható, hogy minden egyes alkalommal minimum 3-4 fajt tudtunk azonosítani (1. táblázat). Az is látható, hogy főként a Planktothrix agardhii volt a domináns a vízvirágzásokban. U- gyanakkor a 2012. év eltérő volt a többihez képest, mivel ebben az esetben egy többnyire Microcystis aeruginosa-t tartalmazó vízvirágzásról beszélhetünk. Az Anabaena spir- oides, az Anabaena circinalis és az Anabaenopsis sp. mennyisége elhanyagolható volt a különböző mintavételek alkalmával. Megvizsgáltuk a Planktothrix és Microcystis fajokra jellemző mikrocisztin termelésért felelős génklasztert, mivel mindkét faj jelentősebb mértékben alkotta a vízvirágzást. Ennél a két fajnál a toxintermelésben mind a génszakaszok méretében, mind az elhelyezkedésükben eltérés figyelhető meg (Nishizawa és mtsai., 1999, 2000; Tillett és mtsai., 2000; Christiansen és mtsai., 2003). Látható (i. kép), hogy 2011.08.03, 2012.08.22 és 2013. 08.26. időpontokban vett mintákban detektálni tudtuk a Microcystis sp. specifikus
