Hidrológiai Közlöny 2011 (91. évfolyam)
6. szám - LII. Hidrobiológus Napok: „Alkalmazott hidrobiológia” Tihany, 2010. október 6-8.
55 Alternatív Daphnia teszt szennyvíz toxicitásának becslésére Kováts Nóra 1 - Ács András 1- Kovács Anikó' - Kárpáti Árpád 2 'Pannon Egyetem, Limnológia Tanszék, 8200. Veszprém Egyetem u. 10 2Pannon Egyetem, Környezetmérnöki Intézet, 8200. Veszprém Egyetem u. 10 Kivonat: A Daphnia-tesztet (A mobilitásgátlás meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea) akut toxicitási teszt (ISO 6341: 1996, Magyar Szabvány MSZ EN ISO 6341:1998)) elterjedten alkalmazzák szennyvíz toxicitásának értékelésére. Bár a szabvány nevében mobilitás-gátlás szerepel, ez valójában mortalitás-vizsgálat. Az egyed pusztulása ugyanakkor egyrészt nem specifikus végpont, másrészt semmiképpen nem tekinthető korai jelzésnek. Saját fejlesztésünk egy táplálkozási-aktivitás gátlás vizsgálatán alapuló teszt, amelynek során a vízibolhákat meghatározott ideig a toxikus komponenst tartalmazó oldatban tartjuk, majd az expozíciós idő leteltével a tesztszervezeteket piros színű mikro-granuiátummal beetetjük. Számszerűsíthető paraméter azoknak az egyedeknek a száma, amelyek táplálkozási aktivitása gátlódott. Jelen kísérletben előülepített kommunális szennyvízminta toxicitását értékeltük a táplálkozás-aktivitáson alapuló teszttel, amely mellett ellenőrző jelleggel a szabványos mobilitás-gátlás tesztet is elvégeztük. A hígítatlan (100 %-os töménységű) szennyvíz százalékában megadva, a Daphnia magna mobilitás-gátlás alapján számított ECso érték 95% konfidencia-intervallum mellett 36.4688±5.4887 % volt, a táplálkozás-aktivitás gátlás teszt alapján kapott EC50 értékek pedig 2 ill. 4 órás expozíciót követően 15.6985± 2.6813 ill. 12.5568±2.3581 %-nak adódtak. Az eredményekből kitűnik, hogy a táplálkozás-aktivitás gátláson alapuló teszt érzékenyebbnek bizonyult. Kulcsszavak: Daphnia, ökotoxikológia, szennyvíz, teszt, táplálkozásaktivitás Bevezetés A környezetvédelmi és vízügyi miniszter 27/2005. (XII. 6.) KvVM rendelete a használt- és szennyvizek kibocsátásának ellenőrzésére vonatkozó részletes szabályokról 2. melléklete szerint a veszélyes és mérgező anyagok toxicitásának vizsgálatára javasolt módszerek a következők: lumineszcens baktérium (MSZ EN ISO 11348), Daphnia-teszt (MSZ 22902:6), statikus halteszt (MSZ 22902:3), algateszt (MSZ EN 28692), ill. a rendelet külön kitér a genotoxicitás megállapítására (SOS Chromotest OECD guidelines No 471:1977 és UMU teszt ISO DIS 13829:2000). A Daphnia magna (nagy vízibolha) gyakorlatilag minden kívánalomnak eleget tesz, ami egy ideális tesztszervezettel szemben támasztható: sokféle víztípusban előfordul, tömeges, magas az ökológiai relevanciája, hiszen fontos haltáplálék-szervezet, a vízibolhák laboratóriumban is könnyen tarthatók és tenyészthetők, végül pedig igen sokféle szennyező komponensre megfelelő érzékenységgel rendelkezik. A nemzetközi szabvány (Vízminőség. A mobilitásgátlás meghatározása Daphnia magna Strauson (Cladocera, Crustacea). Akut toxicitási teszt (ISO 6341:1996, Magyar Szabvány MSZ EN ISO 6341:1998)) előírásai szerint a módszer alkalmazható a) a vizsgálati feltételek között oldható vegyi anyagok, vagy a vizsgálati feltételek között fenntartható állandó szuszpenzió vagy diszperzió; b) kezelt vagy kezeletlen ipari vagy kommunális szennyvízelfolyások, szükség szerint dekantálás, szűrés vagy centrifugálás után; ill. c) felszíni vagy talajvizek akut toxicitásának meghatározására. A vizsgálat során meghatározzuk azt a kezdeti koncentrációt (azaz a teszt megkezdésekor mérhető koncentrációt), amely 24 órás expozíciós idő alatt a vízibolhák 50%-át mozgásképtelenné teszi, az ebben a nemzetközi szabványban meghatározott feltételek között. Ezt a töménységet kezdeti hatásos gátló koncentrációnak nevezzük, és 24 h - EC 5 0i-vel jelöljük. Ha lehetséges, és ha szükséges, meg lehet határozni azt a kezdeti koncentrációt is, amely 48 órás expozíciós idő alatt teszi mozgásképtelenné a tesztszervezetek 50 %-át. Ezt a töménységet 48 h - EC 5 0i -vei jelöljük. Bár a szabvány nevében mobilitásgátlás szerepel, ez valójában mortalitás-vizsgálat. A mozgásképtelen egyedek vagy már elpusztultak az értékelés időpontjára, vagy pedig irreverzibilis károsodást szenvedtek. Bizonyos értelemben a tesztszervezet (az egyed) pusztulása nem is a szennyezés mértékét mutató tünet, biológiai értelemben sokkal inkább következmény. Olyan élettani, szervtani károsodások következtek be, amelyek eredője a szervezet pusztulása. A befogadó vizek és azok élővilágának hatékony védelme érdekében az a szennyezés, amely az ökoszisztéma egyik fontos elemében ilyen mértékű hatást vált ki, nem biztos, hogy elfogadható kockázatnak minősül. A mortalitás ráadásul nem specifikus végpont. Nem tudjuk meghatározni, mi okozta a szervezet pusztulását, milyen hatásmechanizmusa lehet a toxikus komponensnek. A szabvány immobilitás-gátláson alapuló tesztnek ugyanakkor, mint minden szabvány protokollnak, megvannak az előnyei. Ezek közül jelen esetben, a jogalkalmazás szempontjából legfontosabb a reprodukálhatóság: ugyanazon toxikus anyagra a szabványban rögzített körülmények betartásával elvileg valamennyi vizsgáló laboratórium ugyanazt a toxicitást kell kapja (természetesen bizonyos szóráson belül.) Ennek a szórásnak a mértékét külön szabvány határozza meg: kálium-bikromátra, az ökotoxikológiában elterjedten alkalmazott referencia kemikáliára (ezzel ellenőrzik pl. időközönként a törzstenyészetek érzékenységét) az ISO 6341 szabvány szerint az EC 5 0 érték akkor elfogadható ha a 0.6-2.1 mg/L tartományba esik. Szub-letális végpontok Több olyan vízibolhát alkalmazó tesztet ismerünk, ahol valamilyen élettani/viselkedésbeli paraméter a végpont, messze megelőzve a szervezet pusztulását. A gyakorlatban elteijedt a szívverés ütemének vizsgálata. Stresszes környezetben az anyagcsere/keringés felgyorsul, mikroszkópos vizsgálattal nyomon követhető a szívverés ütemének változása (Baylor, 1942). Az úszás különböző paramétereinek, pl. a sebességnek a változása is megfelelő válasz lehet adott toxikus stresszre (pl. Baillieul és Blust, 1999). Egy német cég, a bbe-moldaenke által kifejlesztett Daphnia Toximeter átfolyásos rendszerben működik. Viselkedésbeli anomáliákat, mint pl. az egyedek sebessége, a mozgás iránya, az egyedek egymáshoz viszonyított helyzete a tesztkamrán belül vizsgál (pl. Lecheit et al., 2000). Ezeknek a paramétereknek a rögzítése és értékelése képelemző szoftver segítségével történik. Az on-line Daphnia monitor ennél bonyolultabb változatában a vízibolhákat fluorogén (fluoreszcenciát kiváltó) táplálékkal etetik, tiszta (szennyezésmentes) vízben, normál anyagcsere mellett az állatok fluoreszkálnak. Szennyezett vízben az anyagcsere károsodik, tehát fluoreszcencia nem vagy csak igen csökkent mértékben mutatkozik (pl. Rogers et al., 2005). Egyedszinten további végpontok lehetnek az embrionális fejlődés során bekövetkező károsodások (pl. LeBlanc et al., 2000, Kast-Hutchenson et al., 2001, Zhang et al., 2003, Palma et al., 2008), a vedlés gyakorisága, ill. a vedlés során bekövetkező torzulások (pl. Rohrlack et al., 2004, Zou, 2005, Palma et al., 2008), morfológiai károsodások (pl. Leoni et al., 2008) és természetesen a növekedés mértéke (pl. Villaroel et al., 2003, Brausch et al., 2007). Biomarkerek alkalmazása is ismert (pl. De Coen és Janssen, 1997, Diamantino et al., 2000). Populációs szintű teszteket is ismerünk: az ivadékok száma (pl. Lürling és van der Grinten, 2003, Zalizniak és Nugegoda, 2006) ill. a populáció növekedése (Lürling, 2003) is viszonylag jól mérhető végpontok lehetnek. A reprodukció, mint végpont vizsgálatáról OECD szabvány is rendelkezik (OECD, 1998). Az ivararány alakulása is jellemző válasz lehet specifikus szennyező anyagok, pl. hormonhatású vegyületek toxicitására (pl. Baer és Owens, 1999, Flaherty és Dodson, 2005).
