Hidrológiai Közlöny 2011 (91. évfolyam)
6. szám - LII. Hidrobiológus Napok: „Alkalmazott hidrobiológia” Tihany, 2010. október 6-8.
42 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2011. 91. ÉVF. 6. SZ. A Fertő tó mikrobaközösségeinek jellemzése tenyésztéstől független, csoportspecifikus molekuláris biológiai módszerekkel Felföldi Tamás 1, Somogyi Boglárka 2, Márialigeti Károly 1 és Vörös Lajos 2 1 ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/c. (tamas.felfoldi@gmail.com) 2 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézet, 8237. Tihany, Klebelsberg Kuno út 3. Kivonat: A Fertő tó sekély, alkalikus, mezo-eutróf tó, jelentős része nádassal borított. Számos különböző méretű belső tóval rendelkezik, amelyeket kiteijedt csatornahálózat köt össze egymással és a nyílt vízzel. A Fertő évtizedek óta a biológiai kutatások célpontja, mikroba-közösségeinek genetikai diverzitását azonban kevésbé ismerjük. Jelen munkánkban csoportspecifikus molekuláris biológiai módszereket alkalmaztunk a tó mikrobaközösségeinek megismerése érdekében. A genom különböző régióinak vizsgálatával (riboszómális RNS gének, fikocianin operon) a planktonikus élőlények több csoportjának jellemzését végeztük el (pikocianobaktériumok, eukarióta algák, csillósok stb.). Alkalmazott módszereink között a mikrobiális ökológia genetikai diverzitást felmérő eszköztára szerepelt (klónozás, denaturáló gradiens gélelektroforézis, bázissorrend elemzés). Vizsgálatunk során sikerült azonosítanunk az elsődleges termelésben meghatározó szerepet játszó fotoautotróf pikoplankton képviselőit (Synechococcus sp., Nannochloris sp.). A vizsgált mintáink jelentős térbeli és időbeli heterogenitást mutattak az eukarióta mikrobaközösség összetételét tekintve. Egyes csoportok esetében pedig számos, korábban még nem azonosított, egyedi képviselő jelenléte valószínűsíthető a Fertő tó vizében. Kulcsszavak: planktonikus pikoalgák, zöldalgák, protisták, PCR-alapú molekuláris biológiai technikák, Fertő tó. Bevezetés A planktonikus szervezetek jelentős szerepet töltenek be a vízi közösségek életében, azonosításuk kis méretüknek köszönhetően azonban néhány esetben gondot jelent (lásd pl. Felföldi és mtsai., 2010). Munkánk során néhány ilyen, taxonómiai szempontból nehezen meghatározható csoport jellemzését végeztük el a Fertő tó különböző pontjain vett mintákból. Fő érdeklődésünk a fitoplankton biomasszájához olykor 80 %-ban is hozzájáruló (Padisák és Dokulil, 1994; Somogyi és mtsai., 2010) fotoautotróf pikoplanktonra, más nevén planktonikus pikoalgákra irányult. Két csoportjának, a pikocianobaktériumoknak és a piko-eukarióta algáknak molekuláris biológiai jellemzésén túl a teljes eukarióta közösség, a nagyobb méretű zöldalgák és a csillósok közösségeinek vizsgálatával a Fertő tóban élő (egyéb) planktonikus eukarióta csoportok tagjainak azonosítása is lehetővé vált. 1. ábra. A mintavételi helyek földrajzi elhelyezkedése Anyag és módszer Vízmintáink a Fertő tó öt pontjáról származtak. Két mintavételi hely (Rákosi-öböl; nyílt víz, Balf; mindkettő nyílt víz típusú) a magyarországi tóterületen, míg három az osztrák oldalon helyezkedett el (1. ábra). Ez utóbbiak közül egy nyílt vizű, egy nádassal körülzárt belső tó (Ruster Poschen), egy pedig a Fertő melletti sekély szikes tó (Unterer Stinkersee) volt. Valamennyi esetben felszíni vízmintákat vettünk, amelyeket 15 pm-es planktonhálón szűrtünk át, majd centrifugálással koncentráltunk (4500 g, 15 perc, 150-200 ml minta-térfogat). A DNS kivonása, a PCR és a klónozás a pikociano-baktériumokra irányuló vizsgálatok esetében a Somogyi és mtsai. (2010) által megadott módszerek alapján történt. Az eukarióta mikrobák vizsgálatakor a DNS-t az UltraClean Soil DNA Isolation Kit (MoBio) segítségével vontuk ki a gyártó leírását követve. A Chlorophyta-specifikus PCR-eket (polimeráz láncreakciókat) a Moro és mtsai. (2009) által közölt ChloroF és ChloroR primerekkel, míg a Ciliata-specifikus PCR-eket a Dopheide és mtsai. (2008) által közölt Euk-528F és Cil-1147R primerekkel az említett közleményekben megadott paramétereknek megfelelően. A DGGE (denaturáló gradiens gélelektroforézis) vizsgálatot és a bázissorrend elemzéseket a Felföldi és mtsai. (2008) által használt módszereknek megfelelően hajtottuk végre. Eredmények és megbeszélésük A pikocianobaktériumok genetikai diverzitásának vizsgálatát a Fertő tó két nyílt vizű pontján vett vízmintából végeztük el, mivel korábbi vizsgálatok azt mutatták, hogy ennek a csoportnak a mennyisége nyílt vízben különösen jelentős lehet (főként tavasszal és ősszel; Somogyi és mtsai., 2010; Somogyi és mtsai., 2011) Klónozásos vizsgálatunkkal a fotoautotróf pikoplankton prokarióta tagjait Synechococcwjokként azonosítottuk. A Synechococcus nemzetség polifiletikus, az édesvízi képviselőik többsége azonban egy monofiletikus csoportba (az ún. pikofítoplankton kládba) tartozik, amit több alcsoportra osztottak (Robertson és mtsai., 2001). Mivel a fajok pontos leírása főként a tiszta tenyészetek előállításának nehézsége és a részletes ökofiziológiai vizsgálatok hiánya miatt nem lehetséges (Castenholz és Norris, 2005), ezeket a csoportokat mindmáig betűkódokkal jelölik. A Fertő tóból származó klónok többsége, mindkét vizsgált genomi régió alapján, a talán legáltalánosabban előforduló (legtöbb és legkülönfélébb helyekről kimutatott) A csoporthoz volt köthető; kisebb mértékben a B és C csoport tagjait sikerült azonosítanunk (2. ábra). Néhány klónunk viszont csak kis hasonlósági értékeket mutatott a már ismert genotípusokhoz. DGGE vizsgálatainkat három különböző taxonra specifikusan végeztük el: a teljes eukarióta közösségre (Felföldi és mtsai., 2010 3. ábrája), valamint a Chlorophyta (3.A. ábra) és Ciliata (3.B. ábra) közösségre. Eredményeink jelentős tér- és időbeli változatosságot tükröztek a mintázatokban. A
