Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)
6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.
103 A harkányi gyógyfürdőhöz tartozó karsztkút-vizek baktérium-közösségeinek filogenetikai diverzitása Miseta Roland, Palatinszky Márton, Márialigeti Károly, Borsodi Andrea ELTE Mikrobiológiai Tanszék, 1117. Budapest, Pázmány Péter sétány 1/C Kivonat: A Harkányi Gyógyfürdő tulajdonában lévő harkányi, büdöstapolcai és mattyi vízbázisokra telepített karsztkutak magas szulfidtartalmú vizének baktériumközösségeit szezonális mintavételezést követően molekuláris biológiai módszerekkel tanulmányoztuk. A filogenetikai diverzitás feltárását klónkönyvtárak elemzésével végeztük el, a bakteriális közösségszerkezeteket ökológiai indexek számításával hasonlítottuk össze. A klónkönyvtárak elemzése során foként kén-, szulfid-oxidáló, illetve szulfátredukáló baktérium taxonokat azonosítottunk. A langyos vizű kutak klónkönyvtárainak közös képviselői Epsilon Proteobacteria klónok, a Desulfocapsa sp., valamint a Thiothrix spp. képviselői voltak, míg a termálkút baktériumközössége, amely jelentősen eltért a többi közösségtől, foként a Denitratisoma sp. filotípussal rokon klónokkal volt jellemezhető, de kis számban termofil kénbaktériumokhoz hasonló szekvenciák is előkerültek. Az a zonosított klónok több mint kétharmada kénbaktériumokkal mutatott nagy bázissorrend hasonlóságot, bár a matematikai statisztikai becslések alapján mintáinkból nem sikerült minden filotípust feltárnunk. A klónkönyvtárak közül csak a büdöstapolcai kompozit minta mutatott reprezentatív közösségszerkezeti képet. Kulcsszavak: kénbaktérium, klónkönyvtár, diverzitás, fajgazdagság, fajtelítődés. Bevezetés és célkitűzések Az Európában egyedülálló harkányi kénes karsztvíz 5095 méteres mélységből tör a felszínre a Villányi-hegység felszín közeli karsztpikkelyeiből, melyet a Harkányi Gyógyfürdő langyos vizű és termáikútjaival termelnek ki. A termálkutak a fürdő területén helyezkednek el, talpmélységük 50-75 m, pozitív nyomásúak, szabad kifolyásúak, a gyógyfürdő területe alatti vízadó képződményekből, repedezett dolomitos mészkőrétegekből termelik az átlagosan 60°C hőmérsékletű termálvizet. A langyosvizű Büdöstapolca I. és II. kutak a gyógyfürdőtől 4 km-re keletre találhatók. Talpmélységük 80 m, a kifolyó víz hőfoka 18-23°C között változik. A terület vízadó képződményei kalciterekkel átjárt, üreges, tömött szövetű mészkőrétegek. A Matty-kút Harkánytól délre helyezkedik el 5 km távolságra. A kút talpmélysége 91 m, a vízadó réteg itt szürke mikrokristályos, kalciterekkel sűrűn átjárt mészkő. A kitermelt karsztvizek jellemzően hidrogén-karbonátosak (476-622 mg/l), magas az ásványianyag tartalmuk (730- 900 mg/l). A szulfidkoncentráció a büdöstapolcai és mattyi kutak vizében átlagosan 1,9-6,7 mg/l, a termálkút vizében pedig 11,1 mg/l. A büdöstapolcai és harkányi kutak szervesanyag tartalma kicsi (0,7-1,9 mg/l), míg a mattyi kúté nagy (14 mg/l). A kutak kevert vizét tartalmazó medencevizek többféle oldott és kivált kénformát (oldott szulfid, kivált elemi kén, kénhidrogén gáz, kötött karbon-szulfid) tartalmaznak, melyek a bőrön és a tüdőn át könnyen felszívódva fejtik ki jótékony hatásukat a légző- és a vázizom rendszeren. Jelen munkánk során célul tüztük ki, hogy molekuláris klónozás alkalmazásával betekintést nyerjünk a karsztkutak baktériumközösségeinek összetételébe, ökológiai indexek alkalmazásával meghatározzuk és összehasonlítsuk a baktériumközösségek jellemzőit, és a közösségek összetétele alapján szerkesztett fajtelítődési görbékből megállapítsuk a molekuláris klónkönyvtárak teljességét, reprezentatív értékét a vizsgált közösségre. Vizsgálati anyag és módszerek A Harkányi Gyógyfürdő langyosvizü Büdöstapolca l-es, és Büdöstapolca Il-es kútjait 2006. novemberében, 2007. áprilisban, majd a Matty-kutat 2008. áprilisban, a VI. termálkutat pedig 2008. novemberében mintáztuk. A langyosvizű kutakból 5-5 1 vízmintát vettünk, a VI. termálkútból 25 1 vízmintát gyüjtöttünk, majd a vízmintákat 0,45 jim pórusméretü membránszürővel és 3200 rpm sebességű centrifugálással tömörítettük. A keletkezett felülúszót elöntöttük, és a tömörített üledéket 1,5 ml-es centrifugacsövekbe gyűjtöttük. A közösségi DNS-izolálás és a klónkönyvtárak létrehozása során a korábban leírtak szerint jártunk el (Miseta és mtsai, 2009). A közösségek taxonómiai diverzitásának, becsült fajgazdagságának és fajtelítődésének meghatározását a FastGroup II online calculator segítségével végeztük el ( http://biom e. sdsu.edu/fastgroup/cal_tools.htm). A számítási módszerek abból az alapfeltételezésből indulnak ki, hogy a klónkönyvtárakban azonosított taxonok egymástól egyenlő mértékben különböznek, azaz minden taxonómiai kategória azonos értékű. A közösségi dominanciaviszonyokat nem veszik figyelembe, és mind a mintavételi terület lefedettségét, mind az ökológiai erőforrások mértékét azonosnak veszik. A diverzitás-indexek meghatározásához a Shannon-Wiener öszszefüggést, a becsült fajgazdagság-index és fajtelítődési görbék meghatározásához pedig a Chaol összefüggést alkalmaztuk {Schneider és mtsai, 2004). A Shannon-Wiener összefüggés a fílotípusok számát és a hozzájuk tartozó klónszámot, valamint a klónok eloszlásának egyenletességét veszi alapul. A Chaol összefüggés a klónkönyvtárak összes klónszámát, a fílotípusok számát, valamint az egy klónnal és két klónnal képviselt taxonok számát veszi alapul, és extrapolációval becslést végez a fílotípusok várható értékére. Eredmények és megvitatásuk Az 5 klón-könyvtár elemzése során összesen 211 klónszekvenciát csoportosítottunk restrikciós hasítási mintázatuk alapján, majd a csoportreprezentáns klónok bázissorrend elemzését követően 47 különböző filotípust azonosítottunk. Közülük 26 az anyagcseréjük szempontjából obligát vagy fakultatív kemolitotróf kénbaktériumokkal mutatta a legnagyobb bázissorrend hasonlóságotkönyvtárakra összehasonlító táblázatot szerkesztettünk, ami a reprezentáns klónok számát és a hozzájuk legközelebb álló filotípusokat mutatja be az egyes baktériumközösségekben (1. táblázat). A büdöstapolcai kompozit mintából (BTK) létrehozott klónkönyvtár 81 klónt tartalmazott, melyek 8 filotípusba csoportosultak. Domináns képviselői a Delta Proteobacteria altörzsbe tartozó mező fii, szulfátredukáló Desulfocapsa fajjal rokon szekvenciák (Finster és mtsai, 1998), valamint faji szinten nem azonosítható, környezeti mintákból származó Epsilon Proteobacteria klónok voltak. Az utóbbiak oligotróf, szulfid-tartalmú langyos és termálvizek (melegvizű források, karsztos víztározók, tengeri üledékek) általános közösségalkotói, domináns előfordulásukat több külföldi tanulmányban is leírták (Engel és mtsai, 2004). A kompozit könyvtárban számos további kemolitotróf kénbaktériumhoz hasonló szekvencia jelenlétét igazoltuk Ezek zömmel a Gamma Proteobacteria altörzshöz tartozó szulfidoxidáló fonalas Thiothrix nemzetség két fajával (Howarth és mtsai, 1999) álltak a legközelebbi rokonságban. Ezen kívül kis számban egyéb termofil, kén- és szulfidoxidáló taxonokkal rokon szekvenciákat mutattunk ki. A büdöstapolcai I (BT-I) klón-könyvtárban összesen 8 filotípust azonosítottunk 45 klón szekvencia analízise alapján. A legnagyobb számban
