Hidrológiai Közlöny 2010 (90. évfolyam)

6. szám - LI: Hidrobiológus Napok: „Új módszerek és eljárások a hidrobiológiában” Tihany, 2009. szeptember 30–október 2.

24 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2010. 90. ÉVF. 6. SZ. DNS alapú molekuláris biológiai fajmeghatározás A klasszikus módszerek (mikroszkópos morfológia, törzsek izolálása stb.) mellett egyre meghatározóbb szerep jut a molekuláris biológiai, különösen a nukleinsav alapú technikáknak (1. táblázat). A Balaton planktonikus közösségének denaturáló gradiens gélelektroforézissel és a sávok bázissorrend elemzéssel történő vizsgálatának eredményét láthatjuk a 2. ábrán. A legtöbb esetben a sávokból visszanyert DNS eredete jól azonosítható volt, meg lehetett állapítani, hogy milyen szervezetből származik. A Balanion és Paralellostrombidium fajokhoz legnagyobb hasonlóságot mutató sávok esetében viszont az alacsony hasonlósági értékek elbizonytalanítják az eukarióta szervezetek pontos azonosítását. Ezt két dologgal magyarázhatjuk: (i) a DNS származhat a tudományra új fajból vagy (ii) leírt, de genetikai alapon nem jellemzett (vagy más gén/régió alapján jellemzett) fajból. Mivel a mikroszkopikus méretű eukarióta szervezetek többségét morfológiai alapon írták le és molekuláris biológiai jellemzésük még nem történt meg, ezért a nukleinsav adatbázisok meglehetősen hiányosak, a fenti két lehetőség közötti egyértelmű döntés csak az elkövetkező évek hiánypótló munkáinak fényében lesz majd csak lehetséges. ím ^r cm 9S ä ra g Big 5 o No hN 0) (N - Balanion masanensis {94,6%; Ciliphora/Prorodontida) Protaspis sp. (98,4%; Rhizaria/Thaumatomonadida) Halleria grandinella (98,0%; Ciliophora/Oligotrichia) Protaspis sp, (98,4%; Rhizaria/Thaumatomonadida) Nannochloris bacillarís (98,9%; Chlorophyta/Trebouxiophyceae) Rimostrombidium lacustrís (96.8%; Ciiiophora/Choreotricha) Paralielostrombidium sp. (95,1%; Ciliophora/Oligotrichia) Nannochloris bacillarís (100%; Chlorophyta/Trebouxiophyceae) -Monomashx sp (98,1%; Chlorophyta/Prasinophyceae) -Chrysochromulina parva (99,4%; Haptophyta/Prymnesiaceae) 1. táblázat. A mikroszkopikus méretű eukarióták azonosításánál fBw Eü

d'

aP

lornu

s 3

ra

c'

l'

s (100%; Arthropoda/Copepoda) 2. ábra. A Balaton planktonikus eukarióta szervezeteinek azonosítása DGGE sávok bázissorrend elemzésével fa módszer leírását lásd Felföldi és mtsai (2008); a Diez és mtsai (2001) által közölt EuklA és Euk5I6r-GCprimerekkel, 20-40 %-os denaturáló koncentrációt alkalmazva; a legközelebbi rokon fajhoz viszonyított 18S rDNS %-os hasonlóság és a rendszertani besorolás zárójelben került feltüntetésre A módszer neve A módszer elve A tenyésztéses módszerek (és a törzsek jellemzése) törzsek izolálása tiszta tenyészetek előállítása transzmissziós elektronmikroszkópia (TEM) az áthaladó elektronnyaláb az ultravékony mintával kölcsönhatva teremti meg a képalkotás alapját, felfedve a mintaszelet finomszerkezetét pigment-analízis az adott törzsben előforduló fő pigmentek mennyiségi és minőségi meghatározása direkt szekvencia analízis* adott DNS szakasz(ok) bázissorrendjének összehasonlító vizsgálata restrikciós fragmentumhossz polimorfizmus (RFLP)

f a DNS restrikciós endonukleázokkal történő hasításával kapott mintázatok összehasonlítása a sejtek fluoreszcencia tulajdonságain alapuló módszerek epifluoreszcens mikroszkópia különböző hullámhosszú fénnyel történő gerjesztés segítségével a sejtek pigmentösszetételére lehet következtetni azok autofluoreszcenciája miatt áramlási citometria a folyadékáramlatban haladó sejtek mennyiségének meghatározása és osztályozása méret, fluoreszcens tulajdonság stb. alapján szerológiai módszerek immunfluoreszcens technika fluoreszcens festékek hozzákapcsolása bizonyos sejtfelszíni molekulákhoz (antigénekhez) nukleinsav alapú molekuláris biológiai módszerek fluoreszcens in situ hibridizáció (FISH) a sejtek RNS-éhez in situ fluoreszcens festékkel jelölt taxon-specifikus oligonukleotidok (vagy azok analógjainak) kötése 'dot blot' hibridizáció PCR segítségével amplifikált DNS hibridizáltatása taxon-specifikus DNS próbákkal kvantitatív (real time) PCR a PCR során keletkező termék mennyiségének folyamatos nyomon követésével az amplifikált gén mintában előforduló mennyisége meghatározható klónozás és a klónok összehasonlító bázissorrend elemzése a közösségi DNS (multitemplát PCR termék) szétválasztása rekombináns vektor-kompetens sejt rendszer segítségével denaturáló gradiens gélelektroforézis (DGGE) eltérő GC-tartalmú (és emiatt különböző olvadási tulajdonsággal rendelkező) azonos hosszúságú DNS szakaszok elválasztása növekvő denaturáló koncentrációt tartalmazó poliakrilamid gélben 1 valójában nukleinsav alapú molekuláris biológiai módszerek, Térbeli és időbeli mintázatok keresése A nukleinsav alapú módszerek többségének nagy előnye, hogy viszonylag gyorsan kivitelezhetőek, nagyszámú minta feldolgozása pedig lehetőséget teremt idő- és térbeli mintázatok vizsgálatára. A 3. ábrán a Fertő tóból származó, különböző helyekről és különböző időpontokban vett vízminták DGGE mintázatainak összehasonlítását láthatjuk. Egyértelmű elkülönülések tapasztalhatók a mintavételi helyek és időpontok esetében egyaránt. A minták közötti túl nagy mértékű különbségek (pl. US minták távolsága a többitől, de szélsőséges esetben akár a közös sávok teljes hiánya) viszont megnehezíti az összehasonlítást (mindenki különbözni fog mindenkitől). Ugyanis, ezen esetben az alkalmazott körülmények valamennyi eukarióta élőlény DNS-ének megjelenését lehetővé teszik, a módszer felbontása miatt amelyeket jellemzően izolátumok vizsgálatakor alkalmaznak viszont csak a legdominánsabb tagok jelennek meg sávokként, amik az eltérő mintákban jelentősen különbözhetnek. Nagyobb taxonómiai csoportok vizsgálatakor a PCR technika torzításának lehetősége erőteljesebb lehet, ezért kisebb csoportok célzott vizsgálatát javasolják az ilyen hiba csökkentése érdekében (Vaulot és mtsai, 2008). Specifikus PCR primerek már több eukarióta csoport esetében elérhetők (pl. Cercozoa, Foraminifera, Chlorophyta, Ciliata, Dinophyceae és Chrysophyceae; Bass és Cavalier-Smith, 2004; Dopheide és mtsai, 2008). Korlátok és előnyök Vajon a klasszikus morfológiai-élettani tulajdonságokon (méret, alak, mozgásképesség, pigment-összetétel stb.) alapuló vizsgálatok esetében korábban megfogalmazott aggályok ezen módszerek elvetését jelentenék a mikroszkopikus méretű eukarióták azonosításánál?