Hidrológiai Közlöny 2009 (89. évfolyam)
6. szám - L. Hidrológiai Napok: "A hazai hidrobiológia ötven éve" Tihany, 2008. október 1-3.
60 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2009. 89. ÉVF. 6. SZ. A hazai pikoalgák diverzitásának tenyésztéses és tenyésztéstől független technikákkal történő vizsgálata eredményeként számos értékes adat látott napvilágot. A tenyésztéses vizsgálatok eredményeként 16, a Balatonból valamint a Duna-Tisza közi szikes tavakból izolált pikocianobaktérium törzs molekuláris azonosítását végezték el (Felföldi et al., 2008). Ugyanakkor ezek a vizsgálatok a tavak nyári, legproduktívabb időszakára korlátozódtak, és a tavak téli algáiról csak mennyiségi adatokkal rendelkezünk. Vizsgálataink célja ezért a Duna-Tisza közi szikes tavak pikoeukarióta fitoplankton diverzitásának megismerése volt tenyésztésen alapuló módszerek segítségével. Anyag és módszer A pikoalga törzsek izolálása 1,5 %-os agar (Oxoid) tartalmú módosított „brackish water médium" (BWM) táptalajon történt. A tápoldat alapját a Göttingen-i alga törzsgyüjtemény Culture Media listáján megtalálható BWM tápoldat képezi, ugyanakkor az eredeti tápoldat összetételében használt tengervíz helyett 0,45 pm-es pórusméretű filteren (Millipore) átszűrt szikes tóvizet alkalmaztunk. Az izoláláshoz a vízmintavétel 2005. december 12-én történt a Böddi-székből valamint a Zab-székből. Az algatörzsek tenyésztése során BG11 tápoldat (Rippka et al., 1979) használatára tértünk át, amelyben a mikrotápelemek koncentrációját tizedére csökkentettük. Az algatörzsek fenntartása 21°C hőmérsékleten, 60 pmol m" 2 sec" 1 fényintenzitáson történt 14:10 órás világos:sötét ciklusban. Az izolált algatörzsek morfológiai vizsgálata differenciál interferencia kontraszt mikroszkóp (Olympus BX51), illetve transzmissziós elektron mikroszkóp (Hitachi 7100) segítségével történt. A sejtek pigment tartalmát az ismertetett tenyésztési körülmények mellett fiatal tenyészetben vizsgáltuk, meghatározva az algaszuszpenzió klorofill-a koncentrációját illetve a pikoeukarióta sejtek abundanciáját. A minták pigment tartalmát forró metanolban extraháltuk, majd UV-VIS spektrofotométerrel meghatároztuk a klorofill-a és az össz-karotinoid koncentrációt (Wetzel & Likens, 1991). Az algák abundanciáját epifluoreszcens mikroszkóppal (Nikon Optiphot 2) határoztuk meg kékesibolya illetve zöld geijesztőfény alkalmazásával (Maclsaac & Stockner, 1993). Az algatörzsek molekuláris filogenetikai vizsgálatát 18S rDNS szekvenciájuk alapján végeztük. Az algasejteket folyékony nitrogénes feltárás után 1 mL CLS-Y -ban (Biol01 Systems, Q-Biogene) felszuszpendáltuk, majd a kivont DNS tisztítása G-Spin™ Genomic DNA Extraction Kit (iNtRON Biotechnology Inc.) segítségével történt. A PCR reakciót 18SrRNA-5'-PCR3 és 18SrRNA-3'-PCR3 primerekkel végeztük a Yamamoto et al. (2003) által leírt módon. A kapott termékeket PCR-M™ Clean-Up DNA (Viogene) kit segítségével tisztítottuk, majd a szekvenáló reakciókat BigDye w Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kittel (Applied Biosystems) végeztük el. A kromatogramok manuális korrekcióját követően (Chromas vl.45, Technelysium Pty Ltd.) a szekvenciákat GenBank nukleotid adatbázissal hasonlítottuk össze (Altschul et al., 1997). A filogenetikai fákat MEGA3 (Tamura et al., 2004) programcsomaggal szerkesztettük Neighbor-Joining módszerrel Kimura 2-paraméteres nukleotid szubsztitúciós modellt alkalmazva. Eredmények és értékelésük A Zab-székből és a Böddi-székből összesen 13 pikoeukarióta algatörzset izoláltunk. Ezek közül hét algatörzs 18S rDNS alapú molekuláris azonosítását sikerült elvégeznünk. Az izolált algatörzsek mindegyike zöldalgának (Chlorophyta) bizonyult, öt törzs a zöldalgák Trebouxiophyceae családjába tartozott, két törzs pedig a Chlorophyceae családba. A Böddi-székből izolált ACT0617 és ACT0619 törzs 18S rDNS szekvenciája alapján a Pseudodictyospharium/Mychonastes (Chlorophyceae) csoportba tartozott (1. ábra). Ezt a két alganemzetséget korábban morfológiai alapon különítették el egymástól, a Mychonastes nemzetség egy szorosabblazább kolóniákat képző algaként, a Pseudodictyosphaerium pedig egysejtű algaként lett leírva (Fawley et al., 2005). Később kiderült, hogy különböző tenyésztési körülmények között mindkét csoport egyaránt képes kolóniás és egysejtű formában is tenyészni, molekuláris alapokon pedig úgy tűnik, hogy ez a két csoport valójában egy nemzetség különböző morfológiai változata (Fawley et al., 2005). Az AC T0617 és az ACT0619 algatörzs nagyrészt egysejtűnek bizonyult, bár kisebb-nagyobb sejtcsoportokat is láttunk a tenyészetben. A gömb alakú sejtek átmérője 1,6-2,2 pm volt, de nagyobb, osztódás előtt álló ún. anyasejteket is megfigyeltünk, amelyek maximális mérete 3,3 pm volt. A sejtek klorofill-a tartalma az ismertetett tenyésztési körülmények mellett fiatal tenyészetben 191 fg sejt"', az össz karotinoid tartalom pedig 48 fg sejt" 1 volt. Az algák autosporulációval szaporodnak, az anyasejtből általában 4 leánysejt képződését figyeltük meg. A kloroplasztisz a Chlorella nemzetséghez hasonlóan csésze alakú volt és a nagyobb méretű sejtekben pirenoidot is megfigyeltünk. I Mychonastes sp. AS 7-9 AY195971 1 Mychonastes homosphaera CCAP 211/8e X73996 ' Mychonastes homosphaera AB025423 L- Mychonastes sp. AN 2/29-3 AY195965 Mychonastes sp. Tow 6/3 P-1 w AY197637 ' Pseudodictyosphaerium sp. Itas 9/21 14-4w AY543065 " Mychonactes sp. JL 1/12-12 AY195978 1 ACT 0617 (Böddi-szék) • Lf Mychonastes sp. 2C1 AF357151 Mychonastes sp. 5C3 AF357150 Pseudodictyosphaerium jurisii SAG 37.98 AF106074 ( ( ACT 0619 (Böddi-szék) _MJ 1. ábra: AzACTOól 7 és ACT0619 (Böddi-szék) törzsszámú pikoeukarióta algatörzs filogenetikai helyzete 18S rDNS szekvenciájuk alapján i Choricystis minor SAG 251-1 X89012 I—P- Choricystis sp. 4A3 AF357149 i— Nannochloris atomus SAG 14.87 AB08035 H Choricystis sp. 3D4 AF357148 Chorycystis sp. 1A1 AF357147 i ACT 0610 (Zab-szék) Jl_j Choricystis sp. SAG 251-2 X81965 Nannochloris sp. SAG 251-2 AB080306 ' Q 0 1 ' ACT 0605 (Böddi-szék ) 2. ábra: Az ACT0605 (Böddi-szék) és ACT0610 (Zab-szék) törzsszámú pikoeukarióta algatörzs filogenetikai helyzete 18S rDNS szekvenciájuk alapján A Böddi-székből izolált ACT0605 és a Zab-székből izolált ACT0610 pikoeuakarióta algatörzs 18S rDNS szekvenciája alapján a Choricystis nemzetséghez (Trebouxiophyceae) tartozott (2. ábra). A Choricystis nemzetség filogenetikai viszonyainak tisztázása még napjainkban is tart (Fawley et al. 2005). Az ACT0605 és ACT0610 algatörzs szintén gömb alakú, magányos sejtekkel volt jellemezhető, de kisebb sejtcsoportokat, illetőleg sejtláncokat itt is megfigyeltünk. A sejtek mérete jóval kisebbnek bizonyult, átlagosan 1,2-1,6 pm volt, de az osztódás előtt álló anyasejtek mérete sem haladta meg a 2 pm-t. A sejtek klorofill tartalma az ismertetett tenyésztési körülmények mellett fiatal tenyészetben 46 fg sejt"', az összkarotinoid tartalom pedig 10 fg sejt" 1 volt. Az algasejtek autosporulációval szaporodnak, de egy anyasejtből csak két autospóra képződését figyeltük meg. A
