Hidrológiai Közlöny 2008 (88. évfolyam)
6. szám - IL. Hidrobiológus Napok: „A Balaton és vízrendszere – a Balaton-kutatás története” és „A Duna-kutatás története” Tihany, 2007. október 3–5.
109 juk ismeretében az adott génre tervezett specifikus oligonukleotidokkal (15-25 bázis hosszúságú DNS szakaszok, primerek) azonosíthatóak és polimeráz láncreakció (PCR) segítségével kimutathatóvá válnak. A beállított módszerek segítségével megkezdődött a természetes vizek fitoplanktonjának átvilágítása, toxikus genotípusok azonosítása. A mikrocisztinek családjába sorolt több mint 50 féle variáns számos cianobaktérium fajban megtalálható, s köztük is leggyakrabban Microcystis, Planktothrix és Anabaena fajokban (Mez és mtsai, 1997; Frazier és mtsai, 1998). A nodularint a Nodularia spumigena cianobaktériumban mutatták ki (Mazur és Plinski, 2003), a cilindrospermopszint pedig a Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon flos-aquae, Aphanizomenon ovalisporum, Anabaena bergii, Raphidiopsis curvata és Raphidiopsis mediterranea fajokban azonosították (Banker és mtsai, 1997; Li és mtsai, 2001; Schembri és mtsai, 2001; Preußel és mtsai, 2006; Mohamed, 2007). Ezek a vízvirágzást, vízszíneződést okozó cianobaktériumok a közönséges fitoplankton tagjai hazai vizeinknek is. A mikrocisztinek és a nodularin hepatotoxin, kémiai szerkezetüket tekintve ciklikus peptidek, a szerin/treonin fehérje foszfatáz 1 és 2A inhibitorai (MacKintos és mtsai, 1990). A mikrocisztinek szintézisét a mikrocisztinszintetáz komplex végzi, melyek enzimeit a mcy gének (mcyABCDEFGHIJ) kódolják (1 ábra). A nodularin a nod gének átírását követően szintetizálódik (Dittmann és Wiegand, 2006) . McyE McyD McyA 1. ábra. A hepatotoxinok szintéziséért felelős gének általános struktúrája (Dittmann és Wiegand, 2006) A cilindrospermopszin kémiai természetét tekintve egy alkaloid, amely szintén hepatotoxikus (Hawkins és mtsai, 1985), de fehérjeszintézist gátló hatással is rendelkezik (Terao és mtsai, 1994), továbbá indukálhat karcinogenezist (Humpage és mtsai, 2000) vagy okozhat neurotoxicitást is (Kiss és mtsai, 2002). Három feltételezett enzim vesz részt a cilindrospermopszin szintézisében, az amidinotranszferáz, peptid-szintetáz és a poliketid-szintáz (Kellmann és mtsai, 2006, 2. ábra). A toxikus genotípus jelenlétének kimutatása a toxin szintézisben kulcsszerepet játszó enzimek génjeinek (mcyAQCDEFGHIJ, nod, PS, PKS), specifikus szakaszaira tervezett oligonukleotidok segítségével történik (Schembri és mtsai, 2001; Tillett és mtsai, 2001; Rantala és mtsai, 2004; Valério és mtsai, 2005). A PCR reakciók során a terepmintákkal egy időben izolált törzsek is vizsgálhatók igazoltan toxintermelő törzsek DNS mintáit alkalmazva kontrollként (Kovács és mtsai, 2007). A potenciális toxintermelő képesség kimutatása mellett a módszer lehetőséget nyújt a faj ill. csoport specifikus primerek alkalmazásával a potenciálisan toxikus genotípus rendszertani besorolására is. ücxj glicin i aniu amidinotranszferáz \IS 16"/ -N cilindrospermopszin HaN. V •HjN — N COO guamdin-acetát ATP* malonil-CoA - J pcptid-szintl'tá/. A DP «P, «• CoASH • HCO, inalonil-CoA HjN. > « ""r v , CoASH • HTO, poliketid-s/.intáz /-a S-ACP poliketid-szintáz (ketoreduktáz) Íí Q S-ACP 2. ábra. A cilindrospermopszin bioszintézisében részt vevő gének valószínűsített katalizációs reakciói (Kellmann és mtsai, 2006 nyomán). A toxintermelő képesség molekuláris módszerekkel való kimutatásának gyakorlati vonatkozásai A PCR technikát alkalmazó molekuláris megközelítés előnye az érzékenység és a korai detektálás. Már az algavirágzást megelőző korai, kevés fonalszámú stádiumban előre jelezhető potenciálisan toxint termelő változatok jelenléte az algapopulációban. A természetes vizek algaflórájában kis mennyiségben jelenlevő, valamit az üledékben lappangó potenciálisan toxint termelő genotípusok jelenléte is detektálható, amelyek kimutatására a mikroszkópi vizsgálat vagy a már szintetizálódott toxin kimutatásán alapuló módszerek nem alkalmasak. A molekuláris biológiai vizsgálat során kapott eredményeket azonban a módszer korlátainak ismeretében kell értelmezni. A kérdéses gének kimutatása során a 3. ábrán látható folyamatsort végezzük el a mintavételtől az azonosításig. Három lehetséges hibaforrást azonban figyelembe kell venni az eredmények értékelésénél. (i) Mintavétel; Az időbeli és térbeli mozaikosság minden limnológiával foglalkozó kutatónak problémákat vet fel. Az algák, s valószínűleg a toxikus genotípusok eloszlása sem egyenletes az adott víztérben. A negatív eredmény környezeti mintáknál valószínűsíti a toxikus genotípusok hiányát, de a mintavételi hely heterogenitásából következően nem garantálja azt (meg kell jegyezni, hogy ez a többi módszer esetében is igaz). Ugyanakkor a pozitív eredmény viszont egyértelműen jelzi a potenciálisan toxintermelésre képes genotípusokjelenlétét. (ii) Kimutathatósági határ; A PCR reakció egy nagyon érzékeny módszer, elméletileg az egy kópiában levő célgén is kimutatható, azonban a gyakorlatban ez nem feltétlenül érvényesül. Ezért fontos meghatározni a módszer érzékenységét, azaz azt a legkisebb fonal- vagy sejtszámot, aminél pozitív eredményt kaphatunk. A 3. ábrán vázolt módszer érzékenységét a cilindrospermopszin toxin esetében kísérletesen teszteltük. A C. raciborskii CYN termelő és nem termelő törzseit különböző arányokban kevertük kiindulva egy közepes algavirágzás fonalszámából. A teszt eredménye azt mutatja, hogy a mintaelőkészítés, DNS preparálás, PCR reakció folyamatsorban 1420 nem toxikus fonal között 1 toxikus fonalat tudtunk még biztosan detektálni (4. ábra, 2. táblázat).
