Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)

6. szám - XLVIII. Hidrobiológus Napok: Európai elvárások és a hazai hidrobiológia Tihany, 2006. október 4–6.

163 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 6. SZ. lünk az irodalomban arra vonatkozóan, hogy milyen összefüggés van a limitáló tápanyagok és a eianobakteriális toxintermelés között. Ismert, hogy a természetben megfigyelhető eianobakteriális vízvirágzások, vagy a laboratóriumokban izolált törzsek toxicitása nagymértékű változatosságot mutat, és hogy az egyes virágzások, illetve a törzsek toxicitása időben változhat (van der Westhuizen és Eloff, 1983; Codd és Poon, 1988; Saker és Griffith, 2000). Arra vonatkozóan, hogy a felvehető kén limitált mennyisége hogyan befolyásolhatja a toxintartalmat, nem találunk példát. A nitrogénkötő cianobaktériumok a toxikus vízvirágzások leggyakoribb résztvevői, a vízvirágzások kialakulásában a nitrogén mellett a foszfor az egyik fő szabályozó tényező. Mindezek alapján indokolt annak vizsgálata, hogy milyen összefüggés figyelhető meg a szulfát- illetve a foszfátéhezés, és a cilindrospermopszin tartalom között az A. ovalisporum fonalas, nitrogénkötő cianobaktériumban. Anyag és módszer Tenyésztés: Az izraeli Kinneret-tóból 1994-ben gyűjtött cilindrospermopszin termelő Aphanizomenon ovalisporum ILC-164 törzs fenntartására, illetve tenyésztésére egyszeres ásványianyag tartalmú Allen médiumot használtunk (Allen, 1968, Vasas et al., 2002, 2004). A kénilletve foszforéheztetéshez késői exponenciális fázisig nevelt Aphanizomenon ovalisporum tenyészeteket centrifugáltuk, majd a sejtüledéket szulfátot, foszforéhezés esetén foszfátot nem tartalmazó tápoldatba oltottuk be. A szulfátmentes táptalajban a szulfáttartalmú sókat ekvivalens mennyiségű kloriddal és nitráttal, a foszfátmentes táptalajban a KH2P0

4-ot ekvivalens mennyiségű KCL-dal helyettesítettük (az Allen tápoldat 0,33 mM szulfátot és 8,6 mM foszfátot tartalmaz). A tenyészetek nevelése, illetve a törzs fenntartása állandó fényen (max. 80 pmol/ m

2s fényerő, Polylux XLR fénycsövek) 28°C-on, steril levegővel buborékoltatott 500 ml-es Erlenmayer lombikokban történt. Vizsgálatainkat steril levegővel buborékoltatott 500 ml-es Erlenmeyer lombikokban, 400 ml kiindulási térfogatú tenyészetekben végeztük. A tenyészetek növekedésének nyomon követése: A tenyészetek növekedését a száraz tömeg, a klorofill-a tartalom, illetve a sejtszám meghatározásával követtük nyomon. A száraz tömeg meghatározásához a tenyészetekből naponta 3 ml mintát vettünk, a mintákat centrifugáltuk (7000 rpm, 3 perc Fischer Model 59A), liofilizáltuk, majd ezekből a mintákból határoztuk meg a toxintartalmat is. A klorofill-a meghatározása során a 663 nm-en, 80 %-os acetonban mért fényabszorpció alapján számítottuk a pigment-tartalmat (Bendall et al., 1988). A meghatározáshoz naponta egy alkalommal 200-200 pl mintát vettünk a tenyészetekből. A sejtszámolást JENAVAL mikroszkóppal, 18x18 mm-es fedőlemez alatt végeztük. A sejtszám meghatározásához 5 pl mintát vettünk a tenyészetekből, melyben 12,5x25-ös nagyítás mellett a fonalakat, 40x 25-ös nagyítással a sejteket számláltuk meg. A minta párolgását a fedőlemez körüllakkozásával csökkentettük. A sejtszámot sejt * ml"

1 egységben adtuk meg. A toxintartalom meghatározása: A sejtek tényleges cilindrospermopszin tartalmát a kapilláris elektroforézis módszerével határoztuk meg (Vasas et al., 2002, 2004). A feldolgozást a minták liofilizálása és a száraz tömeg mérése előzte meg. Eredmények A tenyészetek növekedése: Az A. ovalisporum tenyészetek növekedését a foszforéhezés illetve a kénéhezés körülményei között korábban részletesen jellemeztük (Bácsi et al. 2004, 2005). A kísérletek során megállapítottuk, hogy mind a kén-, mind pedig a foszforéhezés - eltérő mértékben ugyan - növekedésgátlást eredményez. Korábbi munkánkban azt is megállapítottuk, hogy az éhezés az indukálható enzimek aktivitás-növekedésében is megnyilvánul (ATP-szulfurilláz a kénéhezés, alkalikus-foszfatáz a foszforéhezés esetén). Az I. ábrán a szulfátéheztetett (üres körök) és a foszfátéheztetett (fekete körök), valamint a kontroll (fekete rombuszok) tenyészetek növekedése látható. Legnagyobb mértékű növekedésgátlást a kénéheztetett tenyészetben tapasztaltunk, 48-72 óra elteltével a növekedés gyakorlatilag teljesen leállt. A foszforéheztetett tenyészet növekedése a kénéheztetett tenyészet növekedésénél jelentősebb, 6-8-szoros növekedés tapasztalható a 14. napra a kiindulási állapothoz képest. A toxintartalom változása: A kontroll tenyészetben a toxintartalom a tenyésztés teljes ideje alatt közel állandó értéket mutatott, a toxintartalom sem száraz tömegre, sem sejtszámra vonatkoztatva nem változott jelentősen az A. ovalisporum sejtekben (2. a ábra, fekete rombuszok). A kénéhezés körülményei között a tenyésztés előrehaladtával a tenyészet cilindrospermopszin tartalma folyamatosan csökkent függetlenül attól, hogy az éhezés a tenyésztés elején (-S; 2. a-b ábra, üres körök), vagy 48 óra elteltével kezdődött (+-S; 2. a-b ábra, üres háromszögek). A toxintartalom csökkenésének mértéke különbözik attól függően, hogy a toxintartalmat száraz tömegre vagy sejtszámra vonatkoztatva adjuk meg (2. a-b ábra). Száraz tömegre vonatkoztatva a kiindulási cilindrospermopszin tartalom körülbelül a 20 %-ára esik vissza 48 óra alatt, míg sejtszám alapján számítva a toxintartalmat, a 48 óra elteltével mérhető mennyiség a kiindulási érték több, mint 40 %-a. A jelenség magyarázatául szolgálnak a növekedés vizsgálata során tapasztaltak. A kénéhezés során nagyon hamar megáll a sejtszám változása, ezzel szemben a száraz tömeg hosszabb időn keresztül emelkedik, azaz, egy sejt száraz tömege nagyobb lesz az éhezés előrehaladtával a felhalmozódó tartalék tápanyagoknak (cianoficin szemcsék, glikogén, polihidroxivajsav - Ortega-Calvo és Stal, 1994; Arifio et al., 1995; Schmidt et al., 1982; Wanner et al., 1986) köszönhetően. így érthetővé válik, hogy miért tűnik száraz tömegre vonatkoztatva ugyanaz a cilindrospermopszin mennyiség „kevesebbnek". Mindez azt sugallja, hogy az adott kísérlet céljától függően, körültekintően kell megválasztani azt a paramétert, amelyre a toxintartalmat vonatkoztatni kívánjuk, (b) 180 160 _ 140 t 120 J 10

0 o — 80 E •co a 6

0 ÖT m 40 20 0 0 50 100 150 200 250 300 350 Idő (óra) I. ábra. Az A. ovalisporum tenyészetek növekedése a sejtszám alapján a szulfátéhezés (-S), a foszfátéhezés (-P) és kontroll körülmények közt A 48 órán át kénéheztetett, majd a szulfátot visszakapott tenyézeten (-+S; 2. a-b ábra, üres négyzetek) a cilindrospermopszin tartalom egy 35^10 órás lag periódus után emelkedni kezdett, a tenyésztés utolsó harmadában elérte a kontroliban mérhető értéket. Amennyiben tehát a szulfátot az éhezés olyan időpontjában adjuk vissza, amikor a tenyészet még regenerálódni képes (48, de legfeljebb 72 órán belül), akkor a toxintermelés is visszaáll az eredeti szintre. A foszforéhezés körülményei között a tenyésztés előrehaladtával a tenyészet cilindrospermopszin tartalma folyamatosan csökkent, függetlenül attól, hogy az éhezés a tenyésztés elején (-P), vagy 168 óra elteltével (+-P) kezdődött (5. a-b ábra, fekete körök, illetve fekete háromszögek), ahogyan azt a kénéhezés esetében is megfigyelhettük. Az eredmények azonban azt mutatják, hogy a foszforéhezés során nem tapasztalható lényeges különbség a toxintartalom csökkenésében a száraz tömegre vonatkoztatott, illetve a sejtszámra vonatkoztatott adatok között (mindkét esetben a kiindulási érték 40 %-ára csökken a cilindrospermopszin tartalom 48 óra alatt; 3. a-b ábra, fekete körök). Ennek magyarázata szintén a növekedésvizsgálatok eredményeiben keresendő. A foszforéhezés során nem tapasztaltunk számottevő különbséget a sejtszám, illetve a száraz tömeg változása között, vagyis a sejtek tömege és száma közel azonos mértékben változott, ezért nincs jelentős különbség a száraz tömegre vonatkoztatott, illetve a sejtszámra vonatkoztatott cianotoxin tartalom között. A 168 órán át tartó éhezés után a foszfátot visszakapott tenyészetben (-+P) a cilindrospermopszin tartalom rögtön, 24 óránál rövidebb lag periódus után növekedni kezdett (3. a-b ábra, fekete négyzetek). Ez is azt bizonyítja, hogy az A. ovalisporum sejtek rövid idő alatt nagy mennyiségű foszfát felvételére, és annak az anyagcserében való gyors hasznosítására képesek. Összegzés A szulfát, és a foszfát hiánya a cilindrospermopszin tartalom csökkenéséhez vezet az A. ovalisporum sejtekben. Ha a toxintartalmat száraz tömegre vonatkoztatva adjuk meg, a kénéheztetett tenyészetben nagyobb mértékben csökken a toxintartalom (a kiindulási érték csanem 80 %-kal csökkent 2 nap alatt). A foszfát hiányában mérsékeltebb csökkenést