Hidrológiai Közlöny 2007 (87. évfolyam)

6. szám - XLVIII. Hidrobiológus Napok: Európai elvárások és a hazai hidrobiológia Tihany, 2006. október 4–6.

84 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2007. 87. ÉVF. 6. SZ . porodási fázisban levő algatenyészeteket centrifugálással (2400 g, 10 perc), a teljes mélységet mintázó vízoszlopmintavevővel gyűjtött fitoplankton mintákat centrifugálással (2400 g, 10 perc) és szűréssel (0,45 (ím nitrocellulóz filter, Whatman) koncentráltuk. Mind az izolátumok, mind a környezeti minták DNS kivonása és tisztítása a Bacterial Genomic DNA MiniPrep Kit (V-gene Biotechnology Ltd.) segítségével történt a gyártó leírásának megfelelően. A dinitrogenáz reduktáz gén (nifH), valamint a cilindrospermopszin bioszintézisében kulcsszerepet játszó peptidszintetáz (PS) és poliketid-szintáz (PKS) gének szakaszainak amplifikása az 1. táblázatban megadott primerek segítségével történt. A PCR reakciók 25 |xl végtérfogata a következő összetevőket tartalmazta: 2 pl genomi DNS, 0,2 mM valamennyi dezoxinukleotidból (ATP, CTP, GTP, TTP), 2 mM MgCl

2, 1 U LC Taq DNS polimeráz (Fermentas), 1 x Taq PCR puffer (Fermentas) és 0,325 pM a megfelelő forward és reverse primerekből (1. táblázat). A nifH gcn specifikus reakció hőprofilja a következő volt: kezdeti denaturáció 98 °C-on 5 percig, ezt követte 40 ciklus (30 s denaturáció 94 °C-on, 30 s anneláció az első két ciklusnál 40, majd a további ciklusokban 55 °C-on, 2 perc extenzió 72 °C-on, majd végső extenzió 72 °C-on 7 percig), míg a PS és PKS gén esetében: kezdeti denaturáció 98 °C-on 5 percig, majd 35 ciklus (30 s 94 °C-on denaturáció, 30 s 55 °C-on anneláció, 1 perc 72 °C-on extenzió, majd végső extenzió 72 °Con 10 percig). A reakciótermékek detektálása 1%-os agaróz gélben történt TBE pufferben pUC Mix, Marker 8 (Fermentas) mellett, etídium-bromidos festéssel UV transzillumi-nátor segítségével. 1. táblázat. A vizsgálat során alkalmazott primerek listája Primer neve Primer bázissorrendje Célzott gén Specifitás Termék mérete Irodalom nifH F 5'-CGT AGG TTG CGA CCC TAA GGC TGA dinitrogenáz reduktáz (nifH) nitrogénkötő cianobactériumok 372 bp Olson és mtsai, 1998 nifH R 5'-GCA TAC ATC GCC ATC ATT TCA CC dinitrogenáz reduktáz (nifH) nitrogénkötő cianobactériumok 372 bp Olson és mtsai, 1998 M4 5'-GAA GCT CTG GAA TCC GGT AA poliketid-szintáz (PKS) cilindrospermopszintermelö cianobaktériumok -650 bp Schembri és mtsai, 2001 M5 5'-AAT CCT TAC GGG ATC CGG TGC poliketid-szintáz (PKS) cilindrospermopszintermelö cianobaktériumok -650 bp Schembri és mtsai, 2001 M13 5'-GGC AAA TTG TGA TAG CCA CGA GC peptid-szintetáz (PS) cilindrospermopszintermelő cianobaktériumok 597 bp Schembri és mtsai, 2001 M14 5'-GAT GGA ACA TCG CTC ACT GGT G peptid-szintetáz (PS) cilindrospermopszintermelő cianobaktériumok 597 bp Schembri és mtsai, 2001 Eredmények és megbeszélésük A niJH gén esetében mind a törzsek, mind a környezeti mintákból kivont DNS esetében megfelelő méretű PCR termékeket kaptunk {2/A. ábra). Ezzel nemcsak azt igazoltuk, hogy valamennyi fitoplankton mintában jelen vannak nitrogénkötő cianobaktériumok, hanem megbizonyosodhattunk arról is, hogy a DNS kivonása és tisztítása valamennyi mintánknál sikeres volt, és a későbbi, toxin génre specifikus PCR-ek esetleges negatív eredménye nem a reakciót gátló inhibitorok jelenlétének köszönhető. A cilindrospermopszin termelésében kulcsszerepet játszó PS és PKS gének jelenlétét bizonyító PCR terméket sem a törzsekben, sem a környezeti DNS mintákban nem kaptunk, pozitív reakciót egyedül az Ausztráliából izolált C. raciborskii esetében figyelhettünk meg (2/B. és 2/C. ábra). Munkánk egyik erénye, hogy az eddigiekkel szemben (Fastner és mtsai, 2003) az izolált törzseken kívül a tesztelésbe bevontuk a különböző időpontokban a tó különböző területeiről gyűjtött fitoplankton mintákat is, mivel ezekben a C raciborskii faj „törzseinek" szélesebb gyűjteményét tudtuk egyszerre letesztelni. így a toxikus genotípus sokkal nagyobb eséllyel mutatható ki, mint a hat balatoni izolátum tesztelésével. Másrészt a közösségi fitoplankton vizsgálatokkal nemcsak C. raciborskii-t tartalmazó mintákat (2. ábra csillaggal jelölve) vontunk be, hanem olyanokat is, amelyekben ezen cianobaktérium jelenlétét a klasszikus ülepítő-kamrás mikroszkópiai számolás (Utermöhl, 1958) nem mutatta ki. A fő célkitűzésünk mellett vizsgálataink tehát arra is rámutatnak, hogy a C. raciborskii mellett vannak-e olyan fajok, amelyek termelik a cilindrospermopszint a Balatonban. Fastner és mtsai (2003) ugyanis beszámoltak arról, hogy két németországi tóban ugyan a cilindrospermopszin kimutatható volt, azonban az onnan izolált C. raciborskii törzsek közül egyik sem termelte ezt a toxint. 2. ábra. A különböző génekre specifikus PCR termékek géleketr oj

or etikus szétválasztása (A: nifH gén, B: PKS gén, C: PS gén; a molekulasúly marker fragmentjeinek méretbeli eloszlását bázispárokban kifejezve tüntettük fel; csillaggal jelöltük a mikroszkópos vizsgálattal bizonyítottan C. raciborskii fonalakat tartalmazó mintákat). Az izolálás során bekövetkező erős szelekción túl erre magyarázatul szolgálhat az is, hogy a cilindrospermopszin termelésére a C. raciborskii mellett egyéb cianobaktériumok is képesek, úgymint az Umezakia natans (Harada és mtsai, 1994), az Aphanizomenon ovalisporum (

Banker és mtsai, 1997; Shaw és mtsai, 1999), az Anabaena bergii (Sc-