Hidrológiai Közlöny 2006 (86. évfolyam)

6. szám - XLVII. Hidrobiológus Napok: Vizeink élővilágát érintő környezeti változások Tihany, 2005. október 5–7.

117 bakteriális polifoszfát-felhalmozást Neisser-festés (Szentmihályi és Bán, 1999) segítségével mutattuk ki. A foszfatáz- vagy a polifoszfát-tesztben pozitív törzseket a továbbiakban hagyományos sejtmorfológiai és biokémiai-élettani tesztekkel (Borsodi et al., 2001) vizsgáltuk. Összesen 30 kódolt tulajdonság alapján, Syntax Hiearchical Clustering szoftver segítségével. Simple Matching koefficiens és UPGMA algoritmus felhasználásával fenotípusos csoportosítást végeztünk. A pontos faji azonosítás céljából a csoportokból legalább egy reprezentáns törzset, továbbá a csoportokon kívül eső törzseket 16S rDNS alapú vizsgálatoknak vetettük alá. Az Alul és HinóI restrikciós enzimek hasítási mintázata (ARDRA) alapján másodlagos csoportosítást végeztünk (MassolDeya et al., 1995), és a genotípusosan is egyedi tulajdonságokat mutató törzseket 16S rDNS szekvencia analízissel azonosítottuk. A kapott szekvenciákat az ARB programcsomagban és a BLAST internetes adatbázisban megtalálható szekvenciákkal hasonlítottuk össze. Eredmények és értékelésük A Kelemen-székből és a Böddi-székből összesen 160, a Balatonból 146 törzset izoláltunk. A foszfatáz aktivitással rendelkező törzsek százalékos aránya az élőhelyek trofikus állapotával inverz összefüggést mutatott (1. ábra). 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 0 1. ábra. A foszfatáz- és polifoszfát-pozitív törzsek százalékos aránya az összes izolátum körében A Siófoki-medencében a törzsek 60 %-a, a Keszthelyi-medencében 53 %-a, a kiskunsági szikesekben átlagosan 40 %-a bontotta a szubsztrátként alkalmazott nátrium-fenoftalein-foszfátot. Bár a laboratóriumi tenyészfeltételek nem tükrözik kellően a természetes viszonyokat, a jelenség hátterében feltehetőleg az alkalikus foszfatáz enzimek repressziója áll. A szerves foszfát-észterek széles spektrumának bontását végző enzimek aktivitását a foszfát formájában (extracellulárisan vagy intracellulárisan) jelenlevő foszfor gátolja (Hulett mtsai, 1996; Hiripi és mtsai, 2001). Ezt támasztja alá az a tény is, hogy a foszfáttartalékkal nem rendelkező törzsek 73 %-a rendelkezett foszfatáz aktivitással, míg a polifoszfát-akkumuláló szervezetek 44 %-a volt foszfatáz-pozitív. A polifoszfátot raktározó szervezetek aránya valamennyi mintavételi hely esetében több mint 75%-os volt, és a trofikus állapottal, valamint az alkalmazott táptalaj minőségével nem mutatott direkt összefüggést. A foszfatáz aktivitásuk, vagy polifoszfát-felhalmozásuk alapján kiválasztott baktériumtörzsek közül a vizsgálatok végéig összesen 241 (Bl: 44, B2: 58, KI: 74, K7: 65) tiszta tenyészetet sikerült fenntartanunk. Valamennyi kiskunsági tenyészet Gram-pozitív volt, és döntő többségük endospórát képzett. A balatoni minták körében a Gram-negatív szervezetek aránya 18% volt. A tenyészetek többsége a hagyományos biokémiai próbákkal szemben meglehetősen inaktív volt. A kiskunsági és a balatoni törzsek egyesített fenotípusos dendrogramján több mint 90%-os hasonlósági szinten 30 csoportot különítettünk el. A legalább két törzset tartalmazó csoportokba a törzsek 85%-a nyert besorolást, 19 törzs csoportok közötti pozícióba került. A törzsek fenotípusos csoportosulásában fel lehetett fedezni a mintavételi helyre, és kevésbé kifejezetten az alkalmazott táptalajra utaló elkülönülést. A csoportok között az elsődleges szétválasztó tényezőnek a glükóz (illetve származékainak) fermentatív hasznosítása mutatkozott, ami mindössze három csoportra, illetve 12 csoportok közti pozíciót elfoglaló törzsre volt jellemző. A nagy molekulájú szerves tápanyagok bontása a többi teszthez képest relatíve nagyobb arányú pozitivitást eredményezett. Lipolitikus észteráz aktivitást a törzsek 47 %-a, zselatináz aktivitást 83 %-uk mutatott. A 16S rDNS szekvenciaanalízis alapján valamennyi kiskunsági csoportreprezentáns baktériumtörzset a kis G+C tartalmú Gram-pozitív Bacillus nemzetség tagjaként azonosítottuk (2. ábra). A törzsek az alkalitoleráns (B. niacini, B. pumilus, B. cereus) és obligát alkalofil (B. cohnii, B. horikoshii, B. halmapalus, B. pseudofirmus) fajokkal mutattak legnagyobb genetikai hasonlóságot. A balatoni tenyészetek által alkotott legnépesebb fenotípusos csoportok képviselőit a B. macroides, a B. pumilus, a B. marisflavi fajok képviselőiként identifikáltuk. A Bacillus génuszba tartozó aerob vagy fakultatív anaerob baktériumok a talajoknak és az üledékeknek jellegzetes kolonizáló szervezetei. Extracelluláris enzimeikkel a nagy molekulájú szerves tápanyagok széles skáláját képesek hasznosítani, endospóraképzésüknek köszönhetően pedig képesek tolerálni a szélsőséges élőhelyi viszonyokat. A fent említett sajátságaik, a késői mintavételi időpontok és a kiskunsági szikes vizekre jellemző extrém feltételek magyarázhatják a laboratóriumi tenyésztés során tapasztalt dominanciájukat, amelyet alátámasztanak a Fertő, a Velencei-tó és a kiskunsági szikes vízterek üledékének korábbi tenyésztésen alapuló mikrobiológiai vizsgálatai is (Borsodi és Sallai 1997; Borsodi et al., 2001, Szabó et al., 2004). A Bacillus-fajok fenotípusos változékonyságát jól tükrözi, hogy a kiskunsági székekből, illetve a Balatonból izolált B. pumilus törzsek különálló, a fenotípusos dendrogramon viszonylag alacsony hasonlósági szintet mutató csoportokat alkottak. A faj kiskunsági képviselőit a balatoni törzsekkel ellentétben a glükóz oxidatív és fermentatív hasznosítása és az ammonifikáció jellemezte. A B. halmapalusként azonosított izolátumok közül egyik sem, a B. cereus tenyészetek közül viszont valamennyi mutatott foszfatáz aktivitást. A további balatoni törzseket a fenő- és genotípusos vizsgálatok alapján a nagy G+C tartalmú Gram-pozitív Arthrobacter és Mycetocola, az alfa-Proteobaktérium Methylobacter, valamint a gamma-Proteobaktérium Pseudomonas, Rheinheimera és Aeromonas génuszokhoz lehetett besorolni. B1 B2 Balaton K1 K7 KNP • foszfatáz % • polifoszfát %