Hidrológiai Közlöny 2005 (85. évfolyam)
6. szám - XLVI. Hidrobiológus Napok: Szélsőséges körülmények hatása vizeink élővilágára, Magyarországi kisvízfolyások ökológiai viszonyai Tihany, 2004. október 6–8.
182 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2005. 85. ÉVF. 6. SZ. Anyag és módszer A mintavételi helyek A vizsgálat során összesen 30 különböző vízmintát vizsgáltunk a következő négy fluorokrómmal megfestve: az Acridine Orange (AO), 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), SYBR Green I, SYBR Green II. A mintákat 2004 nyarának végén vettük a következő mintavételi helyekről: Tisza hosszszelvény különböző pontjairól, Duna-Tisza közi szikes tavakból, szigetközi kavicsbánya-tavakból, hortobágyi horgásztavakból, Tisza menti holtmedrekből, Fertőből, Balatonból, ill. a Hordódi-Holt-Tisza különböző növényboritású pontjairól. A minták széles trofitási skálán helyezkedtek el. Vizsgálati módszerek A teljes planktonikus baktériumszám meghatározásához epifluoreszcens mikroszkópot (Nikon Optiphot 2) használtunk a következő filterkészletekkel: kékes-ibolya (BV-2A) az auto-fluoreszkáló szervezetek számának megállapításához. Az UV (UV-2A) a DAPI, a kék (B-2A) az SYBR Green I, SYBR Green II és AO festékekhez. A megfestett sejteket 0,2 mikrométer pórusátmérőjű fekete polikarbonát membránon szűrtük át. A membránfiltert tárgylemezre helyeztük, és nem fluoreszkáló immerziós olajba ágyaztuk. Fedőlemezzel lefedve 100-szoros nagyítású immerziós objektívvel vizsgáltuk, majd az így készített preparátumokat digitális fotókamerával (Spot RT) fotóztuk A felvételeken a Gimp 1.2.5. képkezelő szoftver segítségével a baktériumok számát 10 látómezőben számoltuk - megfelelő hígításban úgy hogy egy látómezőben 100 db körüli sejtszám legyen. A baktérium abundanciát lml vízmintára vonatkoztatva adtuk meg. Minthogy hazánkban a legelterjedtebb az AODC Acridine Orange Direct Count) módszer, a különböző fluorokrómok összehasonlításakor az eredményeket az AO-al számolt baktérium-számhoz viszonyítottuk, (amelyet 100 %-nak tekintettünk) a többit pedig ennek %-ában ábrázoltuk (3. ábra). Fluorokrómok összehasonlítása Acridine Orange (AO) Az egyik legrégebben használt fluoreszcens festék. A dsDNS-hez, ssDNS-hez és RNS-hez egyaránt, de nem túl szelektíven kapcsolódik. A nukleinsav szálak közé interkalálódik, vagy elektrosztatikusán kötődik (HAUGLAND, 1999.) Fluoreszcencia-fénye kötésmódtól függően változik, intakt DNS-hez kötődve zöld, ssDNS-hez vagy RNS-hez kötődve piros fényű. (Haugland, 1999.) 4,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) Klasszikus sejtmag- és kromoszómaszámláló festék. A B konformációjú dsDNS kis árkához, annak AT-gazdag szekvenciáihoz szelektíven kötődik, vagy kis mértékben az RNS AU-gazdag részeihez is kapcsolódik. A DAPI-RNS komplex azonban hosszabb hullámhosszon mutat fluoreszcens maximumot, mint a DAPI-DNS komplex (HAUGLAND, R.P., 1999.). SYBR Green I és SYBR Green II Az SYBR Green I és II -t egyaránt real-time PCR elemzéshez használják, mint igen szelektív dsDNS ill. RNS festékeket (.HAUGLAND, R. P., 1999.) Az epifluoreszcens összes baktériumszám ill. biomassza meghatározásban a háttér-fluoreszcencia csökkentésére és a baktériumsejtek nem eléggé specifikus festődéséből adódó hibák mérséklésére eredményesen használták és ajánlják, mivel élénk fluoreszcencia-fényük könnyíti a detektálhatóságot. (M. G. Weinbauer, C. Beckmann, M. G. Höfle; 1998.) Eredmények és következtetések Az 1. ábrán látható, hogy a DAPI-val számolt baktérium abundancia közelíti meg leginkább az AO baktériumszám értékeit. Eredményeink azt mutatták, hogy az Acridine Orange és a DAPI javasolható a teljes planktonikus baktérium-szám meghatározásához, a hazai állóvizek vizsgálatához. A legmodernebb „zöld" fluorokrómok, az SYBR Green I és SYBR Green II használata a Noble and Fuhrman (1998) által ajánlott eljárás alkalmazásával a legtöbb vízminta esetében a baktériumok abundanciájának nagyfokú alulbecsléséhez vezetett. Köszönetnyilvánítás A munka az OTKA T042977 támogatásával készült. Irodalom: Clarke, K.R., Joint, I.R.. 1986: Methodology for estimating numbers of free-living and attached bacteria in estuarine water. Appl Environ. Microbiol. 51, p. 1110-1120. Haugland, R..P., 1999. Nucleic acid detection and genomics technology. Handbook of fluorescent probes and research products. Molecular Probes 9. edition., p. 278-313. Hobbié, J.E., Daley, R.J., Jasper, 5.1977: Use of nuclepore filters for counting bacteria by fluorescence microscopy. Appl. Environ. Microbiol. 33, p. 1225-1228. Jones J. G., Simon B. M., 1975: An investigation of errors in direct counts of aquatic bakteria by epifluorescence microscopy, with reference to a new method for dyeing membrán filters. J. Appl. Bacteriol. 39: 1-13. McNamara, C. J., Lemke M. J., Lefff, L. G. 2003. Unterestimtion of bacterial numbers in starvation-survival mode using the nucleic acid stai DAPI. Arch. Hydrobiol. 157, 3, p. 309-319. Nakazato, R., Watanabe J. 1994. Examination of direct counting methods for bacteria in lake sediment by epifluorescence microscopy. Jpn. J. Limnol., 55,3, p. 213-221. Noble,R..T., Fuhrman, J.A..1998: Use of SYBR Green I for rapid epifluorescence counts of marine viruses and bacteria. Aquat. Microb. Ecol. 14, p. 113-118. Porter, K.G., Feig, Y S., 1980. The use of DAPI for identyfying and counting aquatic microflora. Limnol. Oceanogr. 25, 943-948. Suzuki, M. T., E.B. Sherr, and B.F. Sherr. 1993. DAPI direct counting underestimates bacterial abundances and average cell size compared to AO direct counting. Limnol. Oceanogr. 38, p. 1566-1570. Weinbauer,M.G., Beckmann, C., Höfle, M. G.1998: Utility of green fluorescent nucleic acid dyes and aluminium oxid membrán filters for rapid epifluorescence enumeration of soil asand sediment bacteria. Appl. Environ. Microbiol. 64, p. 5000-5003. Data sampling of the new methods of direct epifluorescens microscopic quantifying of water bacteria Zsigó, K. - Tóth, A. - Vörös, L. - Teszárné Nagy, M. Abstract: This paper is about the comparison of epifluorescens microscopical technics of measuring bacterial number. We made our examination on some different types of Hungarian, natural water. Different fluorochrome cloured bacteria cells were filtered to black policarbonate filter; quantity of these cells was determined by direct counting.This method is perfect for oecological researces. It results more complete picture / overall picture of natural disperse of bacterial cells as indirect methods, why at the moment of sampling we can establish with direct counting the number of all live or dead bacterial cells. Keywords: fluorochrome, Acridine Orange, DAPI, SYBR Green I, SYBR Green II, abundance of bacteria.
