Hidrológiai Közlöny 2004 (84. évfolyam)
5-6. szám - XLV. Hidrobilógus Napok „Vizeink hosszú idejű változásai” Tihany, 2003. október 1–3.
166 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2004. 84. ÉVF. Kis-Balatonból izolált cianobaktériumok mikrocisztin tartalmának meghatározása Tóth Eszter 1, Surányi Gyula 1, Dinya Zoltán 2, Bácsi István', Vigvári Tünde', Borbély György' Debreceni Egyetem, TTK, Növénytani Tanszék 1, Debreceni Egyetem, TTK, Szerves Kémiai Tanszék 2 4010. Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: A 2001, 2002, 2003. években meghatároztuk a Kis-Balatonból gyűjtött, Microcystis aeruginosa-1 tartalmazó planktonminták cianotoxin tartalmát. A toxicitás kimutatásához növénytesztet, a vegyületek szerkezetének meghatározásához tömeg-spektrometriai módszereket alkalmaztunk. Kulcsszavak: Microcystis aeruginosa, HPLC-DAD, MS, mikrocisztin Bevezetés Az édesvizekben és a tengerekben élő cianobaktériumok tanulmányozása az elmúlt évtizedekben a figyelem középpontjába került, mivel az általuk termelt biológiailag aktív anyagok környezeti problémát okozhatnak (Vasas 2002). A cianobaktériumok által termelt másodlagos metabolitok, kémiai természetüket illetően, a peptidek, a poliketonok, az alkaloidok és a lipopoliszacharidok csoportjába tartoznak. A mikro-cisztineknek, amelyeket különböző cianobaktérium fajok termelnek (Microcystis, Anabaena, Plantroterix, Nostoc), olyan heptapeptid vázú hepatotoxinok, amelyeknek több mint 65 izoformája ismeretes. Kutatócsoportunk régóta foglalkozik különböző cianobaktériumok által termelt cianotoxinok (Vasas 2002, M-Hamvas M 2002) (mikrocisztin-LR, cilindropermopsin) növényi morfológiára, fehérjemintázatra gyakorolt hatásának vizsgálatával. Tesztnövényként mustár csiranövényt illetve mini nád növényeket alkalmazva, melyek indikátorai a toxikus anyagoknak és helyettesíthetik az állatkísérleteket (Vasas 2002). Vizsgálataink célja a 2001, 2002, 2003-as években a Kis-Balatonból izolált plankton-minták cianotoxin tartalmának jellemzése volt. Anyag és módszer A Kis-Balatonból származó planktonmintákból a cianobaktériumokat szűréssel és/vagy centrifugálással koncentráltuk. Az így nyert üledékből számos mikrocisztin típusú vegyületet izoláltunk, melyek száma és minősége az egyes években eltérő volt. Valamennyi vegyület esetén a tisztítás utolsó lépésében DAD-HPLC-t alkalmaztunk, amely segítségével könnyen felismerhetőek voltak a mikrocisztint tartalmazó frakciók, jellegzetes spektrumuk alapján. A vegyőletek szerkezetét MS spektrumok alapján határoztuk meg. Az izolátumok és a minták mikrocisztin tartalmának biológiai jellemzése mustárteszt segítségével történt. Az eljárás során előcsíráztatott mustármagokat neveltünk agarral szilárdított, planktonmintából származó kivonatot tartalmazó táptalajon, etiolált körülmények között, majd négy nap elteltével mértük a csíranövények gyökér- és hipokotil hosszát, a növekedésgátlást 50 %-os gátló koncentrációval (IC J 0) adtunk meg. Analitika A cianotoxinok izolálása, tisztítása valamennyi minta esetén (2001, 2002, 2003) azonos eljárás szerint történt, a mennyiségi illetve minőségi összehasonlítás érdekében. Első lépésben a sejteket centrifugálással (Beckmann centrifuga, JA10-es rotor) összegyűjtöttük, illetve szűrtük. Az így kapott masszát háromszor lefagyasztottuk 20C°-on, majd metanollal (1:3) extraháltuk 10 órán keresztül 4C°-on. A bepárolt maradékot 5 mM Tris-HCl, pH = 7,5 pufferben vettük fel. Centrifiigálás után a felülúszót DEAE cellulóz oszlopra vittük, amit előzőleg 5 mM Tris-HCl pH = 7,5 pufferrel ekvilibráltunk, majd az elúcióhoz 0-100 mM NaCl lineáris gradienst, 5 mM Tris -HCl-ban alkalmaztunk. A növényteszthez (mustár csíranövény) 200 pl térfogatú mintát használtunk fel a frakciókból, amelyekhez beszárítás után agarral szilárdított Allen médiumot adtunk A növényteszttel toxikusnak ítélt frakciókat C-18 Sep-Pack Plus tölteteken tisztítottunk tovább. A töltetek kondicionálása metanollal, majd 10 %os metanollal történt. A toxinok lemosásához metanolt használtunk. Amennyiben szükséges volt, egy további Toyo Pearl tisztítást is alkalmaztunk. Az utolsó tisztítási lépés HPLC-vel történt. A toxikus anyagok elválasztására C-18-as kolonnát és acetonitril:víz = 40:60 eluenst használtunk. A frakciók toxicitását növényteszttel detektáltuk. A vegyületek azonosítása tömegspektrumuk alapján történt. Eredmények 1., A 2001, 2002, 2003-as években a Kis-Balatonból származó Microcystis aeruginosa-X tartalmazó planktonmintákból mikrocisztineket mutatunk ki (l.ábra). 2., A 200l-es izolátumban alapvetően 4 mikrocisztint tudtunk kimutatni, ezek a MCYST-LY, [D-Ser 7] MCYST-EE(OMe), MCYST-HilR, [Dha 7] MCYST-FR. 3., A 2002-es minta toxicitásáért alapvetően a MCYST-RR felelős 4., A 2003-as minta vizsgálata jelenleg folyamatban van; a DEAE cellulózos tisztítás után négy elkülönülő toxikus frakciócsoportot kaptunk, melyek a mikrocisztinekre jellemző nekrotikus foltok megjelenését illetve jelentős növekedésgátlást idéztek elő a tesztnövényeken. 5., A vizsgálatok bizonyították, hogy a mustárteszt (BGST) alkalmas és eredményes módszer a különböző kémiai szerkezetű mikrocisztinek biológiai aktivitásának jellemzésére. összegzés: Az irodalomban eddig leírt közel száz mikrocisztin variáns közül a MCYST-LR és MCYST-RR a leggyakoribb. Az általunk izolált mikrocisztinek a ritkán előfordulóak közé tartoznak, a MCYST-FR-ről még IC 5 0, LD 50 érték sincs. Köszönetnyilvánítás: A kutatómunka feltételeinek megteremtéséért köszönjünk az OTKA T22988 számú pályázatok támogatását.
