Hidrológiai Közlöny 2004 (84. évfolyam)
5-6. szám - XLV. Hidrobilógus Napok „Vizeink hosszú idejű változásai” Tihany, 2003. október 1–3.
50 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 2004 . 84. ÉVF. Kivonat: Fitokelatinok előfordulása Chlorella pyrenoidosa zöldalgában Cr(VI) stressz hatására Hörcsik T. Zsolt 1, Szalay Gabriella 2, Pál Magda 2, Oláh Viktor 3, Mészáros Ilona 3, Lakatos Gyula 3, Balogh Árpád 1 Nyíregyházi Főiskola, 4400. Nyíregyháza, Sóstői út 31/b. 1 Magyar Tudományos Akadémia Mezőgazdasági Kutatóintézete, 2462. Martonvásár, Brunszvik u. 2. ' Debreceni Egyetem, 4010. Debrecen, Pf.:22 A nehézfém kötő proteinek egyik osztálya a fitokelatinok, melyet előzőleg számos magasabb rendű növényből izoláltak. E peptidek ismétlődő y-glutamil-cisztein részleteket tartalmaznak, 5-21 aminosav hosszúságúak karboxil végükön általában glicinnel. A fitokelatinok részt vesznek a növényi nehézfém homeosztázis fenntartásában és a detoxifikációban. Funkciójuk analóg a gombákban és állatokban található metallotioneinekkel. Jelen munkánkban a fitokelatin-szintézis kulcsenzimét a y-Glu-Cys dipeptidil-transzpeptidáz ismertebb nevén fitokelatin-szintáz működését vizsgáltuk Chlorella pyrenoidosa-ban különböző koncentrációjú Cr(VI) kezelések hatására HPLC-technika segítségével. Legfontosabb eredményünk az enzimaktivitás kimutatása volt, mivel a Cr(VI) nem jellegzetes induktora a fitokelatinoknak. Alacsonyabb Cr(VI) koncentrációknál (0,5-1 mg/L) a fitokelatin szintézis intenzívebb volt, mint a magas (5-10 mg/L) kezelések esetében. 20 mg/L koncentráció esetében a szintézis elhanyagolható volt. Megvizsgáltuk a szintézis időbeli lefutását is, amely a nem letális koncentrációk esetében az első 24 órában növekvő majd fokazatosan csökkenő tendenciát mutat. Chlorella, nehézfém-stressz, Cr (VI), fitokelatin-szintáz, pombe sejtek viszont hiperszenzitívek lettek Cu-stresszre (Clemens és mtsai., 1998) jelezvén, hogy a fitokelatin-szintáz szintézis fontos lehet a Cu detoxifikációjában. Kiderült, hogy a fitokelatin- szintáz jelenléte elengedhetetlen a normál toleranciához, számos nem esszenciális fém, különösen a Cd esetében. A Cd hypertoleráns sejtvonalak megnőtt fitokelatin-szintézissel válaszoltak a Cd stresszre, köszönhetően a megnövekedett y-glutamil-cisztein szintáz aktivitásnak (Chen és mtsai., 2001). Korábbi munkáinkban megvizsgáltuk a Cr(VI) Chlorella pyrenoidosa-ra. kifejtett több élettani hatását (Oláh és mtsai., 2003), illetve ezek biokémiai hátterét. Jelen munkánkban arra voltunk kíváncsiak, hogy Cr(VI) terhelés hatására felhalmozódik e a króm az algákban és ha igen melyik sejtfrakcióban. A Cr(VI) stressz hatására, aktiválódik e a fitokelatinszintáz a Chlorella pyrenoidosa-ban, illetve milyen a szintézis időbeli lefiitása és koncentrációfüggése. Anyag és módszer Kísérleteinkhez Chlorella pyrenoidosa IAM-C128 zöldalgát használtunk amelyet a Tokiói Egyetem (Japán) Alkalmazott Mikrobiológia Tanszékéről szereztünk be. A tenyésztéshez és a kísérletekhez használt vegyszereket a Sigma Chem. Co. (St. Louis, USA) és a Serva Fine Biochem. Gmbh.-tól (Heidelberg, Németország) szereztük be. Az algákat C-30 tartalmú agaron tartottuk fenn. A sejtek szaporítását C-30 táptalajon, steril algatenyésztő csövekben végeztük. Az algakultúrákat 4% C0 2 tartalmú levegővel buborékoltattuk át, mely szénforrásként szolgált, stabilizálta az algaszuszpenzió homogenitását és pH-ját 7.2 értéken. A sejteket folyamatos fluoreszcens fénnyel világítottuk meg (18 W/m 2) és 25 ° C-on tartottuk a teljes tenyésztési periódus alatt. A kultúrákat a kezelés előtt 3-4 napig tenyésztettük, amíg el nem értük a kb. lxlO 5 sejt/ml sűrűséget. Cr(VI)-ként K 2Cr 20 7-ot használtunk, a kultúrákat 0.1-50 mg/L (ppm) koncentrációkban kezeltük. A Cr(VI) kezelés után a tenyésztést 72-98 óráig folytattuk. A mikroelem tartalom meghatározásához az algasejteket desztillált vízben mostuk kétszer, majd French-press-szel roncsoltuk azokat. A sejt frakcionálásához Okamura és mtsai. módszerét használtuk (Okamura és mtsai. 1994). Az elemösszetétel meghatározását Spectroflame típusú ICP atomemissziós spektrofotométeren végeztük (ICP-AES) (Spectro Gmbh Kleve, Németország). A fitokelatinok vizsgálatához a centrifugálással összegyűjtött algákat desztillált vizes mosás után újra centrifugáiKulcsszavak: Bevezetés A növények fejlődésükhöz nélkülözhetetlen mikroelemeket (Zn, Cu) vízi és szárazföldi környezetükből veszik fel, amely azonban gyakran tartalmaz különböző oxidációs állapotban lévő toxikus nehézfém-ionokat is (Cd, Cr, Pb, Hg). Ezen esszenciális és nem esszenciális fémek a természeti és humán hatások eredményeképpen egyes esetekben alacsony, más esetekben magas koncentrációban jelenhetnek meg adott területeken. A változó környezetben a növények képesek alkalmazkodni ezen bioreaktív fémek megemelt belső koncentrációihoz. A különböző alkalmazkodási stratégiák és mechanizmusok lehetővé teszik azt, hogy az esszenciális fémek koncentrációja a hiánytüneteket okozó és a toxikus határ között helyezkedjen el, míg a nemesszenciális fémeké a toxikus határ alatt maradjon. A fitokelatinok kisméretű fémkötő peptidek. Jellegzetes összetételük (y-glu-cys)„-gly, (y-glu-cys) n-ß-ala, (y-glucys)„-ser, (y-glu-cys)„-glu, (y-glu-cys)„-gln, (y-glu-cys)„, ahol az n értéke 2-11 érték között változhat (Klapheck és mtsai. 1994) Szintézisüket glutationból, hidroximetil-glutationból, y-glutamil-ciszteinből történik fitokelatin szintáz elnevezésű transzpeptidáz segítségével. Az enzim poszttranszlációs nehézfém aktiválást igényel (Chen és mtsai. 1997). A fitokelatin-szintáz aktivitását nehézfémek széles skálájával (Cd, Zn, Ag, Pb, Cu, Hg, Sn, Au, As) sikerült előidézni. A fitokelatin-szintáz termelés lehetősége minden magasabb rendű növényben és és az algák többségében is megvan. Az enzim aktivitását megmérték számos gombában (Miensch és mtsai. 2001). Érdekesség, hogy a Caenorhabdites elegáns fonálféregben megtalálható egy fitokelatin-szintáz gén, mely helyreállítja az enzim szintézisét és a Cd toleranciát egy fitokelatin-szintáz hiányos Sacharomyces pombe mutánsban, ami azt jelzi, hogy funkcionális fitokelatin szintáz gének előfordulnak állatokban is (Clemens és mtsai., 2001). A fitokelatin szintáz funkciójának megítélésében jelentős változásnak lehetünk tanúi. Kezdetben a sejt homeosztázisának fenntartásában, ill. esszenciális nehézfémek Zn és Cu szállításában tartották jelentősnek (Thumann és mtsai. 1991). Ugyanakkor ezen sejtekben általában magas Cu és Zn koncentrációkat mértek, gyakran a normál szint felett, közel a toxicitási határhoz. Fitokelatin-szintáz hiányos Arabidopsis cad 1 mutánsokban sem számoltak be magasabb fémigényről, valamint nem mutattak jelentősen megnövekedett szenzitivitást Cu, vagy Zn-ionokra (Howden és mtsai. 1995). Roncsolt fitokelatin-szintáz génekkel rendelkező S.
