Hidrológiai Közlöny 2004 (84. évfolyam)
5-6. szám - XLV. Hidrobilógus Napok „Vizeink hosszú idejű változásai” Tihany, 2003. október 1–3.
17 Az Aphanizomenon ovalisporum cianobaktérium periplazmatikus alkalikus foszfatáz enzimének vizsgálata foszforéhezés körülményei között Bácsi István, Vasas Gábor, Surányi Gyula, Tóth Eszter, Tóth Szilvia, Borbély György Debreceni Egyetem, TTK, Növénytani Tanszék, 4010 Debrecen, Egyetem tér 1. Kivonat: Foszforlimitált körülmények között vizsgáltuk egy toxikus Aphanizomenon ovalisporum cianobaktérium törzs növekedését, az alkalikus-foszfatáz enzim aktivitásának változását, valamint a sejtek és a tápoldat foszfáttartalmának változását. Jellemeztük a foszfor újból hozzáférhetővé válása során az éheztetett tenyészet regenerálódását, az indukálható enzim aktivitásában bekövetkező változásokat és a sejten belüli foszfátkoncentráció változását. A faj növekedését a foszforéhezés a második hét végére csaknem a felére csökkenti. Ezt a klorofill-a, fehérje- és szárazanyag-tartalom méréseink is alátámasztották. Az alkalikus foszfatáz enzim aktivitása jelentős mértékben változott a foszforéhezés során: a 14. napra az éheztetett tenyészetben, a kontroliban mérhető értékekhez viszonyítva jelentős (háromszoros) aktivitásnövekedést tapasztaltunk. A sejtek foszfáttartalma nagymértékben csökkent a foszforéhezés során, a foszfor újból hozzáférhetővé válásával azonban a sejtek rövid idő alatt nagy mennyiségű foszfor felvételére voltak képesek. Meghatároztuk az indukálható alkalikus foszfatáz enzim pH-optimumát, hőmérséklet-, idő-, és szubszttátfüggését. Cianobaktérium, foszforéhezés, indukálható alkalikus foszfatáz fenntartását fényen (max. 80 ^unol/mVs) rázatott, illetve levegővel buborékoltatott tenyészetek segítségével végeztük. A rázatást 200 ml-es Erlenmayer lombikokban, Brunswick típusú rázógépen (100-120 rpm) folytattuk. A szárazanyag-tartalom meghatározása: A tenyészetekből minden második napon 3 ml mintát vettünk, a mintákat centrifugáltuk (7000 rpm, 3 perc), majd mosás után liofilizáltuk (fagyasztva szárítottuk). A klorofilltartalom meghatározása: A tenyészetek növekedését klorofill-a méréssel is (ng kl-a/ml) nyomon követtük. A klorofill meghatározása során a 663 nm-en 80%-os acetonban mért fényabszorpció alapján számítottuk a pigmenttartalmat. A meghatározáshoz naponta egy alkalommal 200-200 nl mintát vettünk a tenyészetekből. A növekedésváltozásokat 14 napos időszak alatt követtük nyomon, az ettől idősebb tenyészetek már stacioner kultúrának számítanak. A fehérjetartalom mérése: A fehérjetartalom meghatározásához napi egy alkalommal 200-200 |il mintát vettünk a tenyészetekből. A fehérje kivonást jégen végeztük, a sejtek feltárását háromszori fagyasztással értük el. A kivonatok fehérjetartalmát Bradford módszerrel határoztuk meg (Bradford, 1976). Enzimológiai vizsgálatok: Az alkalikus foszfatáz enzim aktivitását Ihlenfeldt és Gibson (1975) módszere szerint in situ mértük. A reakcióelegyben a PNPP-ből átalakított PNP mennyiségét 400 nm-en, a felülúszóból spektrofotometriásán határoztuk meg a sejteket nem tartalmazó eleggyel szemben. A fényabszorpció alapján optikai denzitás különbséget, majd a fehérjetartalom ismeretében specifikus enzimaktivitást számoltunk (átalakított mM PNP/mg fehérje/óra). Az 1. ábra a foszfor-éheztetett Aphanizomenon ovalisporum tenyészet alkalikus foszfatáz enzimének pH függését mutatja. 50. Kulcsszavak. Bevezetés. A cianobaktériumok prokarióta, fotoszintetizáló élőlények, vagyis az eukarióta mikroalgákkal ellentétben sejtjeik nem tartalmaznak valódi sejtmagot és más, membránnal határolt sejtorganellumot. A fotoszintetikus pigmentek tilakoid membránrendszerbe szerveződtek, amelyek a protoplazma perifériális részén helyezkednek el (Bryant, 1994). Napjainkban a felszíni vizek minőségének egyre előrehaladottabb romlása következtében mind gyakoribb jelenség a vízvirágzás. A vlzvirágzás kifejezés alatt a felszíni vizekben a planktonszervezetek tömeges elszaporodását értjük, amely a vfz intenzív elszíneződéséhez és zavarosodásához vezet (Reynolds et al. 1975). Toxikus vízvirágzásról abban az esetben beszélünk, amikor a vízvirágzásban előforduló plankton szervezetek olyan anyagcseretermékeket termelnek, amelyek egérvagy más tesztben a kezelt szervezetek pusztulásához vezethetnek. Az Aphanizomenon ovalisporum nevű cianobaktérium toxicitását, a faj növekedése során bekövetkező toxintartalom-változásokat korábban jellemeztük. (Vasas et al. 2002). A toxikus cianobaktériumok és a vízi fauna közötti interakciókon túl egyre nagyobb figyelmet fordítanak e szervezetek vízi növényekre gyakorolt hatására is. Tanszékünkön is folynak kutatások ez irányban. A tesztnövényként mustárt alkalmazó vizsgálatok kimutatták, hogy a toxikus cianobakteriális anyagcsere termékek hatást gyakorolnak a magasabb rendű növények nukleáz aktivitására, fehérje-összetételére, morfológiájára (M-Hamvas M. et al. 2001, 2003). A nád sejtszuszpenziós tenyészetekben és szövettenyészetekben végzett vizsgálatok ugyancsak a cianotoxinok növényekre gyakorolt gátló hatására világítanak rá (Máthé Cs. et al.. 1998, 2001). A cianobakteriális vizvirágzások kialakulásában kitüntetett szerepet játszik a felszíni vizekben előforduló nitrogén és a foszfor mennyisége. Az eukarióta algák számára optimális N:P arányt (16-23:1/N:P) összehasonlítva a vízvirágzást előidéző cianobaktériumok számára optimális aránnyal (10-16:1/N:P), látható, hogy ez az arány a cianobaktériumoknál alacsonyabb (Chorus és Bartam eds., 1999; Reynolds et al., 1975). A cianobaktériumok a foszfort ortofoszfát formájában veszik fel, a foszforfelvétel mértéke pH 7,5-8,5 között optimális (Healey, 1982). A foszforhiány hatására a cianobaktériumokban új enzimek szintetizálódnak. Ilyen de novo szintetizált enzim az alkalikus foszfatáz, amely a sejtfal periplazmatikus részébe transzponálódik (Donan és Jensen, 1977; Ihlenfeldt és Gibson, 1975). A felhasználható külső és belső foszforkoncentráció szabályozza az alkalikus foszfatáz aktivitását (Healey és Hendsel, 1975). A belső foszforkoncentráció csökkenésével nő az enzimaktivitás (Healey, 1982). Sok heterotróf élőlényhez és fotoszintetikus algához hasonlóan a polifoszfát szemcsék általában a cianobaktériumok vegetatív sejtjeiben találhatók (Stanier, 1977). A kutatások azt mutatják, hogy foszforhiány esetén a polifoszfát szemcsék foszforforrást jelentenek a nukleinsavak és a foszfolipidek bioszintézise, a sejtanyagcsere számára. Anyag és módszer Munkánk során az 1994-ben az izraeli Kinneret-tó vízvirágzásából származó toxikus Aphanizomenon ovalisporum törzzsel dolgoztunk. Az izolátum a Debreceni Egyetem Növénytani tanszékének törzsgyüjteményében BGSD-423 jelöléssel szerepel. Tenyésztés: Az Aphanizomenon ovalisporum törzs fenntartására, illetve tenyésztésére egyszeres ásványi anyag tartalmú Allen médiumot használtunk. A foszfátéheztetéshez késői exponenciális fázisig nevelt Aphanizomenon ovalisporum kultúrákat centrifugáltuk, majd a sejtüledéket foszfátot nem tartalmazó médiumba oltottuk be, amelyben a K 2HPO«-ot ekvivalens mennyiségű KCl-dal helyettesítettük. A törzs 10 11 pH 1. ábra A foszforéheztetett Aphanizomenon ovalisporum tenyészet alkalikus foszfatáz enzimének pH függése Az intra- és extracelluláris foszfortartalom meghatározása: A foszfor tartalom meghatározásához Ames és Dubin (1960) módszerének módosított változatát alkalmaztuk a minták roncsolása során. Kémcsőbe helyezett liofilizált mintákhoz 0,1 ml alkoholos MgNOj oldatot adtunk. Az elegyet láng fölött teljesen beszárítottuk, majd 0,5 ml HCl hozzáadása után egy éjszakán át 80°C-on tartottuk. A beszáradt mintákhoz 0,1 ml H 2Oj-t adva tettük teljessé a roncsolást. A kémcsőtartalmat 0,3 ml 0,5 M HCl oldatban vettük fel, egy órás 40°C-on való állás után centrifugáltuk. A foszfortartalmat ammónium-molibdenátot tartalmazó komplexképző segítségével spektrofotometriásán határoztuk meg (The Tools of Biochemistry - T G. Cooper, 1977).
