Hidrológiai Közlöny 1999 (79. évfolyam)

4. szám - A Magyar Hidrológiai Társaság XVII. Országos Vándorgyűlése, Miskolc, 1999. július 7–8.

376 HIDROLÓGIAI KÖZLÖNY 1999. 79. ÉVF. 6. SZ. A pH hatása hal embriók légzésének biokémiájára Szabó Marianne

1, G.-Tóth László

2, Lakatos Gyula

1 és Dennis Webb

3 1 Kossuth Lajos Tudományegyetem, Alkalmazott Ökológiai Tanszék, H-4010. Debrecen, Pf.: 22. 2 MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézete, H-8237. Pf.: 35. 3 Université de Rennes L, Laboratoire de Physiology Cellulaire, 35042. Rennes Cedex, Francé. Kulcsszavak: hal embrió, elsavasodás, légzési enzim-rendszer, intracelluláris pH, környezeti pH Bevezetés A savas ülepedés következtében a világon sok tízezer tó és folyó vizének kémhatása pH 7,3-7,5 értékről 4,0 alá csökkent. Halszaporitó és ivadéknevelö tógazdaságok vize viszont a zsúfolt ivadék kiválasztási termékei miatt (pl. ammónia) ellúgosodhat. A fejlődő halembriók bizonyos mértékig képesek az intracelluláris pH-t protonpumpák működtetésével stabilizálni. A vízi környezet szélsőséges pH ingadozásai azonban okozhatnak múlékony intracelluláris pH változást. Savas terhelés esetében számos olyan enzim működése hátrányt szenvedhet, amelyek pH optimuma a lúgos tartományba esik. A legrégibb ilyen ismert példa a "hatching enzim" gátlása savas vizekben, amikor a kelésre érett embrió nem tudja ezzel az enzimmel az ikraburkot belülről elemészteni és nem tudja azt elhagyni. A légzési enzimrendszer teljes köre is az enyhén lúgos tartományban működik optimálisan. A szikanyag mobilizálásában, az energia ATP-be vitelében és az embrionális légzésben a terminális elektrontranszport rendszer (ETS) játsza a legfontosabb szerepet. Kísérleteink során a ponty (Cyprinus carpio), a busa (Hypophthalmychthis molitrix), az amur (Ctenopharyngodon idella) és a bálin (Aspius aspius) embrióinak fejlődését és ETS-aktivitását tanulmányoztuk eltérő pH viszonyok között. Arra a kérdésre kerestük a választ, hogy befolyásolja-e a változó környezeti pH az embriogenezist és az ETS embrionális evolúcióját? Anyag és módszer A kiválasztott négy halfaj, a ponty, a busa, az amur és a bálin ikráit megtermékenyítéstől a kikelésig inkubáltuk szűrt (Whatmann GF/F, pórusméret: 1 fim) és átlevegőztetett csapvízében (kontroll) és az azzal készült különböző kémhatású oldatokban. A pH oldatok készítéséhez biológiai puffereket (MES pH 4, 5, 6; HEPES pH 7, 8 és AMPSO pH 9, 10) használtunk. A bálin anyahalak a Balatonból, a ponty a Tiszából, az amur és a busa ikrák tógazdaságból származtak. A bálin mesterséges megtermékenyítése 5-6 °C-on történt az MTA Balatoni Limnológiai Kutató Intézetében (Tihany) és a vele kapcsolatos vizsgálatok is itt történtek. A ponty, busa és amur megtermékenyítése a hajdúszoboszlói Bocskai Halászati Termelőszövetkezet keltető helyén történt, ahonnan az ikrákat 1 órán belül hűtőtáskában 15-16 °C-on szállítottunk a KLTE Alkalmazott Ökológiai Tanszék laboratóriumába (Debrecen) további kísérletekre. A laboratóriumban a megtermékenyített bálin ikrákat 5-6 °C-on, a többiét 22-24 °C-on, átlevegőztetett csapvízzel ill. párhozamosan szűrt tó-vízzel többször átmostuk, majd levágott hegyű pipettával 50 ill. 70 darabonként, sztrereomikroszkóp segítségével, 300 ml-es Erlenmeyer lombikba osztottuk szét, amelyeket előzőleg 250 ml frissen készült inkubáló oldatokkal töltöttünk meg. A kontrollok három párhuzamban, a pH neveltek 3-5 párhuzamban készültek. A lombikokat az ikrákkal 5-6 °C-ra (bálin), ill. 22-24 °C-ra (ponty, busa, amur) beprogramozott termosztáló szekrénybe helyeztük. Az oldatokat naponta frissre cseréltük. Óránként, kétóránként vagy naponta ellenőriztük az ikrák fejlődését, mortalitását Az elpusztultakat azonnal eltávolítottuk. Az ETS-aktivitást G.-Tóth et al. (1995) szerint mértük. A méréshez az embrionális fejlődés különböző szakaszaiban mintákat vettünk ki a lombikokból, amelyeket a biokémiai vizsgálatokig -30°C-on tároltunk (Yamashita és Bailey, 1993). Eredmények A busa és az amur embriogenezise az alkalmazott 22-24 °C -on 24 óra alatt lezajlott. A busa ikrák túlélése általában kisebb volt, mint az amuré (/. ábra). Mindkét halfajnál a savas kezelés hatására csökkent a túlélés , pH 4-en 5 %, pH 6-on 30 %, pH 9-en 80-100 %, illetve pH 10en 60 és 100 % között változik Hasonló eredményt kaptunk a ponty esetében (2. ábra), ahol viszont három nap volt az embrionális fejlődés. Megemlítjük, hogy inkubációk történtek pH 3 és 11 értéken is, de ezek 24 órás hatása már letális volt, ezért ezeket az adatokat a grafikonunkon nem is tüntettük fel. Kissé lassabb, két-három nap inkubáció 100 %-os mortalitást okozott pH 4 és 6-on is és csak pH 7 és 9 között érte meg bizonyos számú ponty embrió a kikelést. A pH erős hatással volt mindegyik vizsgált halfaj ETS-aktivitására is az embriogenezis folyamán. Azonban, a lúgos közeg a savashoz képest kevésbé befolyásolta azt. A busa esetében a pH 6-on 25 %-kal magasabb ETS-aktivitást mutattunk ki 24 órás inkubáció után, mint pH 8on (3. ábra). Hasonló volt a tapasztalatunk a ponty esetén is, amikor 48 órás inkubáció után pH 7-en sokkal magasabb ETS-aktivitást találtunk, mint pH 10-en (4. ábra). A bálin ikráknál az alacsony pH-n inkubált embriókban szintén magasabb ETS-aktivitás alakult ki, mi

ni magasabb pH értékek mellett (5. ábra) 120 -i • amur 80 60 40 20 H 0 1. ábra Busa és amur embriók túlélése különböző pH-n 24 órával a megtermékenyítés után, 24 °C-on • pH 4 C pH 8 100,1 • pH S * pH » . » pH 6 v pH 10 ao 55 60 ** •S 5 40 inkublciös Ide <h) 2. ábra A ponty embriók túlélése különböző pH-n 24 órával a megtermékenyítés után, 22-24 "C-on nevelve Megbeszélés Az általunk alkalmazott ETS-teszt az embriók respirációs enzimrendszere v^-át adja, tehát a kapott ETS- aktivitás értékek arányosak az embriók által szintetizált ETS mennyiségével. Vizsgálataink általános tapasztalata az volt, hogy fordított a kapcsolat az embriókból kimutatott ETS mennyisége és az inkubáló közeg pH-ja között. Az embriók több enzimet szintetizáltak, ha alacsonyabb pH-n inkubáltuk őket, mint az ETS in vitro pH optimuma (pH 8.4-8.6; G.-Tóth el al. 1995). Több enzim szintézise embriók esetén két okból lehetséges. Több enzimet szintetizálnak az embriók savas közegben azért, hogy több energiát (ATP) mobilizáljanak a fokozottan igénybe vett proton kiválasztó rendszer energia ellátására az intracelluláris pH stabilan tartása védett. Ugyanakkor, több enzim szintézise lehetséges egy környezeti elsavasodást követő intracelluláris pH csökkenés közvetlen hatására is. Amikor a ci-