Hidrológiai Közlöny 1998 (78. évfolyam)
4. szám - Fülöp István Antal–Józsa János: A neruális hálózatok világa
296 HPLC-s pigmentanalízis a fitoplankton diverzitásának vizsgálatában Hiripi László, Kovács Attila és Vörös Lajos MTA Balatoni Limnológiai Kutatóintézete, Tihany Kivonat: A jelen munka célja az volt, hogy az irodalomból ismert HPLC-s pigment meghatározási módszerek közül átvegyünk egy olyan módszert, amellyel az algatenyészetekböl és a felszíni vizekből gyűjtött mintákból azonosítani és kvantitatíve mémi tudjuk a fotoszintetikus pigmenteket. E célra egy diódasoros detektorral felszerelt Waters HPLC-t és Lichrospher RP-C 1 8-5|J-OS oszlopot használtunk. A pigmentek elválasztására, azonosítására és kvantitatív mérésére a Mantoura és Llewelyn (1983) módszerének kismértékben módosított változatát használtuk. Eredményeink összhangban az irodalmi adatokkal azt mutatják, hogy a cianobaktériumok biomasszája rendszeresen ellenőrizhető, ha méijük az e fajokra jellegzetes pigment koncentrációt. Eredményeink alapján azt is megállapítottuk, hogy nem minden cianobaktérium faj tartalmaz zeaxantint, ( pl. Cylindrospermopsis raciborskii, Aphanizomenon flos-aquae) ezért nem a zeaxantint hanem más xantofill, pl. echinenon mennyiségének meghatározása révén lehet a cianobaktériumok biomasszáját meghatározni. Kulcsszavak: cianobaktérium, pigmentanalizis, HPLC Bevezetés Az algák különböző fotoszintetikus pigmenteket (klorofill-a,-b,-c, karotinoidok, xantofillok, fikobiliproteinek stb.) tartalmaznak. Néhány fotoszintetikus pigment, pl. a klorofill-a, p-karotin minden algában megtalálható, míg bizonyos xantofillok, vagy a fikocianin csupán a fajok egy csoportjában fordul elő. így az egyes pigmentekről egy adott faj vagy fitoplankton csoport felismerhető. A fitoplankton biomasszájának rutinszerű meghatározására a klorofill-a koncentrációjának fotometriás vagy fluorimetriás mérése szolgál. E módszerek hibái olyan mértékűek is lehetnek, hogy a klorofill-a koncentrációját a valóságos értéknél 50-100 %-os eltéréssel is mérheti (Otsuki és Takamura, 1988, Trees et a/.,1985, Jacobsen, 1982). A fitoplankton összetételének és biomasszájának meghatározása általában fordított mikroszkópos eljárással történik történik (Utermöhl, 1958) ami nagyon időigényes, és esetenként ugyancsak pontatlan eredményt ad (Wilhelm et al., 1991). Az emiitett mérési hibák kiküszöbölhetők, illetve a vizsgálatok rutinizálhatók ha az alga pigmentek azonosítása és kvantitatív mérése HPLC-s módszerrel történik. A pigmentösszetétel taxonómiai információval is szolgál, ami a vízgazdálkodási gyakorlat számára szintén nem elhanyagolható szempont (pl. a potenciálisan toxikus kékalgák mennyiségi jellemzése). Az alga pigmentek valamint átalakulási termékeik azonosítása és pontos mérése révén nagyon hasznos információhoz jutunk a pelágikus élőlényegyüttes állapotát illetően is. A klorofill-a koncentrációja a fitoplankton biomasszáját jellemzi, a xantofillok a taxonómiai összetételről informálnak. A pigmentek átalakulási termékei a trofikus kapcsolatokról szolgálnak felvilágosítással. így pl. a klorofill átalakulása feoforbiddá a többsejtűek által elfogyasztott alga mennyiségére utal (Carpenter el al., 1986, Leavitt et al., 1989, Leavitt-Carpenter 1990). A fükoxantin alkohol származékká alakul enzimatikus hidrolízis révén ha az algát növényevő fogyasztotta (Repeta és Gagosin, 1984). így a HPLC-s pigment analízis hasznos kiegészítője a klasszikus planktonvizsgálati módszereknek a vízi élőlényegyüttesek komplex tanulmányozása során. Kísérleteink célja az irodalomból ismert HPLC-s módszer beállítása a planktonikus algák pigmentjeinek azonosítására és kvantitatív mérésére. Emellett célunk volt vizsgálati eljárás és értékelő módszer kidolgozása az egyes jelentősebb taxonómiai csoportok (elsősorban a kékalgák) mennyiségi becslésére, a pigmentdiverzitás és a fajdiverzitás összehasonlítására. Anyag és módszer A tenyészetekből, vagy természetes vizekből származó algasejteket centrifugálással, vagy szűrőcentrifugálással tömörítettük, majd 90 %-os hideg acetonban ultrahangos szonikálással homogenizáltuk. A homogenizátumot 4° C-on, 6000 fordulaton, 10 percig centrifugáltuk. A felülúszó aliquotját ionpárképző hozzáadása után (100 |j.l acetonos extraktumhoz 30 p.1 ionpárképző oldat) injektáltuk a kolonnára (Lichrospher 100-5, RP-18, Macherey-Nagel). A kromatográfiai elválasztáshoz a következő összeállítású Waters készüléket használtunk. 2 db 510-s pumpa, automatikus gradiens kontroller, U6K injektor, 990 tipusu diódasoros detektor. A pigmentek elválasztásához kis mértékben módosítottuk a Mantoura ésLlewellyn (1983) gradiens eluciós módszerét. Kiindulásként 100 %os A oldatot áramoltattunk. A mozgófázis összetételét a minta injektálása után 8 perc alatt 100 % A oldatról lineáris gradiens szerint 100 % B oldatra módosítottuk, 1,5 ml/perc áramlási sebességet használva. A B oldatot izokratikusan további 17 percig áramoltattuk, majd a 100 % A oldatra váltottunk át, és az ujabb injektálásig, legalább 7 percig ezt az oldatot áramoltattuk. Az A oldat összetétele, 90 % metanol-10 % ammónium acetát, a B oldat összetétele 80 % metanol-20 % aceton volt. Az ionpárképző olyan oldat volt, amelynek 100 ml-e 1,5 g tetrabutilammónium acetátot és 7,7 g ammónium acetátot tartalmazott A pigmentek azonosításához Cylindrospermopsis raciborskii, Microcystis aeruginosa, Aphanizomenon flos-aquae, Selenasrum capricornutum és Nitzschia palea tiszta tenyészeteit használtuk. A pigmenteket a kromatogram egyes csúcsainak retenciós ideje, és a kromatogram elnyelési spektruma alapján azonositottuk. A kromatogram görbe alatti területe a pigment mennyiségének meghatározására szolgál. Az autentikus klorofill-a és klorofill-b valamint a p-karotin vegyületeket a Sigma-tól vásároltuk. Az oscillaxantint, mixoxantofillt, zeaxantint, echinenont, M. aeruginosa-bó\ és C. raciborskii-bó\ izoláltuk. Eredmények és értékelésük. Az elmúlt időben számos HPLC-s módszert publikáltak az algapigmentek elválasztására és mennyiségi mérésére (Mantoura és Llewellyn, 1983, Zapata et al., 1987, Wright et al., 1991, Wilhelm et al., 1991). Az elválasztási módszer fontos követelménye, hogy a zöldalgákra jellemző lutein és a cianobaktériumokban előforduló zeaxantin elválasztása megfelelő legyen. Eredményeink alapján megállapítható, hogy a Mantoure és Llewelly (1983) módszer kis mértékű módosítása és a Lichrosper kolonna alkalmazása lehetővé teszi a lutein és a zeaxantin elválasztását. A tiszta tenyészetekkel felvett kromatogrammok alapján (1. ábra) megállapítottuk, hogy a C. raciborskii, A. flos-aquae a kékalgákra jellemző négy pigment közül oszcillaxantint, mixoxantofilt és echinenont tartalmaz, mig a M.aeruginosa mixoxantofillt, zeaxantint és echinenont. A kovamoszatokra jellemző fucoxantin, diadinoxantin és a kloroftll-c a N. palea, és a zöldalgákra jellemző lutein csúcs jelenik meg a S. capricornutum algákban. A kékalgák biomasszájának becslésére legelteijedtebben a zeaxanthin mennyiségének a mérését használják. Eredményeink alapján azonban egyértelművé vált, hogy nem minden kékalga, így a Balatonban olykor tömeges C. raciborskii és az A. flos-aquae nem tartalmaz zeaxantint, így véleményünk szerint a zeaxantin helyett az echinenon alkalmasabb a kékalgák biomasszájának becslésére. A kékalgák biomasszájának becslésekor készíteni kell a klorofillra és a referens pigmentre (pl. echinenon) egy kalibrációs görbét. Tiszta tenyészetet használva meg kell határozni a referens pigment/klorofill-a arányát, és ezen arány ismeretében kiszámítható, hogy az ismeretlen mintában talált referens pigment mennyi klorofill-anak felel meg. Irodalmi adatok igazolják, hogy a pigment analízissel és a sejtszámlálással meghatározott kékalga biomassza mértéke jó egyezést mutat (Wilhelm et al., 1991). Tihanynál és a Kis-Balatonnál gyűjtött minták esetében meghatároztuk a kékalga biomassza arányát a sejtszámlálási és pigmentanalízis módszerrel. A két módszerrel kapott adatok (2. ábra) alátámasztják azon irodalmi adatokat, hogy a biomassza aránya pigmentanalizissel is pontosan meghatározható. A pigmentanalizis jól használható a diverzitás meghatározására is. A diverzitás számszerű mértékét leggyakrabban a fitoplankton együttesek faj-abundancia viszonyainak jellemzésére használják, ami szoros kapcsolatban van pl. a fotoszintetikus pigmentek eloszlásával, diverzitásával. Szélsőséges, de nem túl ritka esetben a fajdiverzitás nulla, viszont könnyű belátni azt, hogy egy faj tisztatenyészetében sem lehet a pigmentdiverzitás nulla, hiszen pl. a Balatonban olykor egyeduralkodó Cylindrospermopsis raciborskii-bó\ ötféle pigmentet mutattunk ki. A pigmentdiverzitás felső határa ezzel szemben alacsonyabb, mint a fajdiverzitásé, hiszen az egysejtű algákból összesen alig több, mint 50 féle pigmentet mutattak ki, ezzel szemben egy-egy vízmintából akár 100 algafaj is előkerülhet. Kevés párhuzamos mérési adat van a kétféle diverzitás összehasonlító elemzéséhez, példaképpen egy balatoni és egy kis-balatoni mérés eredményeit mutatjuk be (3. ábra.). Figyelemre méltó, hogy mindkét esetben a pigmentdiverzitás (H) bizonyult magasabbnak, aminek oka a nagyobb egyenletesség (J) volt.
