Hidrológiai Közlöny 1997 (77. évfolyam)
82 A különböző módszerekkel meghatározott a-klorofill koncentrációk összehasonlíthatóságának problémája Kóbor István Közép-Dunántúli Vízügyi Igazgatóság, Székesfehérvár Bevezetés Az a-klorofill a leggyakrabban és legelterjedtebben használt trofitAsi paraméter a felszíni vizek vizsgálatában. A magyar gyakorlatban 1993-ig a Felfdldy-féle meghatározás volt a legelterjedtebb. 1994. november 1 töl a nemzetközi standardnak megfelelő, MSz-lSO 10260 számú Magyar Szabvány használata az előirt A két módszer között számos laboratórium esetében a két módszer között jelentós különbség adódott. Mások tapasztalatai szerint a különb^ ség elhanyagolható. Ez arra utal, hogy az eltérés feltehetően sok paramétertől függ, fgy mértéke utólag nem megállapítható. Ez a hosszabb adatsorok összehasonlíthatóságát, így például az a-klorofill értékeken alapuló trofitás-előrejelző rendszerek kidolgozásának esélyeit erőteljesen rontja A mi próba-méréseink alapján a különbség jelentősnek tünL Emiatt rendszeresen meghatároztuk párhuzamosan a Felfdldy-módszere és az MSz-ISO szerint is az a-klorofill értékeket hogy megállapítsuk a közöttük tapasztalható különbségeket illetve az esetlegesen alkalmazható korrekciós faktor mértékét Tapasztalataink szerint az MSz-ISO szerinti meghatározás átlagosan 32 %-kal alacsonyabb értékeket adott, de a különbség nagy mértékben filgg több különböző paramétertől. Anyag és módszer A módszerek részletes leírása megtalálható Fellöldy: "A biológiai vízminösltés" című könyvében (Felföldy, 1987) illetve az MSZ-ISO 10260 számú magyar szabványban. A két módszer elve fo vonalaiban azonos. A szűrés során a szűrőbetéten összegyűlt algákból forró alkohollal vonjuk ki a klorofillt. A forró kivonatot lehűtjük, majd centrifugálással (vagy szűréssel) eltávolítva a zavarosodást okozó lebegő anyagokat, fotometrálással határozzuk meg a pigment-kivonat fényelnyelését. Ebből számolással (a fajlagos adszorpciós koefficiens alapján) határozzuk meg az a-klorofill koncentrációt. A fotometrálás során az a-klorofill meghatározásánál a Felföldy módszer nem számol a klorofill bomlástermékek jelenlétével, így az a-klorofill koncentrációt túlbecsülheti (Szilágyi, 1982). Az MSZ-ISO szerinti meghatározásnál az extraktum savazás utáni visszamérésével az a-klorofill koncentrációt a feofitinek mennyiségével módosítja. További eltérések: a Felföldy módszer szerint a szűréshez felületi (membrán)szűrőt vagy mélységi (üveg)szűrőt, oldószerként metanolt kell alkalmazni. A másik esetben az oldószer etanol, a szűrőbetét mélységi (üvcg)szűrő. Az általunk, a rutinszerű a-klorofill meghatározásához a Felföldy-féle, metanolos extrakciót, valamint az MSZ-ISO szerinti etanolos extrakciós módszert az alábbi metódus szerint használtuk: A Felloldy-módszer: Az ismert térfogatú vízmintát vákuumszűrön 0,45 |i pórusátmérőjű cellulózacetát membránszürőre szűrtük. A membránt zárható extraháló csőbe helyeztük, majd 12 cm J metanolt pipettáztunk rá. A csöveket légmentesen lezárva 75-80° C-os termosztátban melegítettük. Rövid forralás után az extraktumol lehűtöttük, majd zárható centrifúgacsőbe pipettáztuk át A zavarosság megszüntetéséhez 10 percig 1500 percenkénti fordulaton centrifugáltuk. A fclülúszóból pipettával leszívott extraktum fényelnyelését 1 cm-es küvettában, 666 és 750 nm-en mértük. Az a-klorofill koncentrációt a következő képlettel számoltuk: C.= (17,12. EM(S-8,68. E« 5J), m/M E»SJ; a 653 illetve 666 nm-en mért abszorbancia (a 750 nm-en mért zavarossággal módosítva) M: a leszűrt vízminta térfogata (cm') m: a pigment extraktum térfogata (cm') Az MSZ-ISO szabvány: Az ismert térfogatú vízmintát vákuumszürőn üveg-szűrőlapra szűrtük. A szűrőbetétet zárható extraháló csőbe helyeztük, majd 12 cm' 90 %-os etanolt pipettáztunk rá. A csövet lezárva 90-95° C hőmérsékletű vízfürdőn forrásig- hevítettük. (A szabvány szerinti, alacsonyabb hőfokon az extraktum nem forrt fel.) Az extrahálás során többször felráztuk. Rövid forralás után az extraktumot lehűtöttük, majd zárható centrifuga csőbe pipettáztuk át 10 percig, 1500 percenkénti fordulaton centrifugáltuk. Mérés clőtl az extraktum felülúszójál leöntöttük. A leöntött extraktum fényelnyelését 665 és 750 nm-en mértük, majd cm'-enként 1 pl HCI-oldatot adtunk hozzá, majd 10-15 perc várakozás után újból lemértük Az a-ldorofill koncentrációt a következő képlettel számoltuk ki: C.= (E„5-Em 5 p). 29,6. m/M Ca: a-klorofill koncentráció (mg/m') EMI:EMSJ'- a 665 nm-en savazás előtt és után mért abszorbancia (a 750 nm-en mért zavarossággal módosítva) M: a leszűrt vízminta térfogata (cm') m. a pigment extraktum térfogata (cm') A vizsgálatok során a Reanal által forgalmazott vegyszereket használtunk. A szűrést Sartorius vákuum-szűrő készüléken végeztük. Szűrőbetétként a Paratrade Kft. állal forgalmazott CA 0,45(t pórusméretű membránszűrőt, valamint a Millipore gyártmányú APFB04700 katalógusszámú üvegszűrőt használtuk. Az extraktumok hevítésére Block-Therm termosztátot, az oldószer és a sósav adagolására automata pipettákat (Biohit gyártm. 1-5 ml és 5-20nl térf,) alkalmaztunk. A fotometrálást Zeiss Specord fotométeren 1 cm-es küvettákkal végeztük. Az összehasonlító méréseket a rutin mérési programhoz csatoltan végeztük el, így a viszonylag nagy mintaszám miatt párhuzamos vizsgálatokat csak alkalmanként tudtunk elvégezni. A tapasztalt különbségek okainak kiderítésére néhány alkalommal a szűrőbetétet felcseréltük. Az elemzésekhez tavak és tározók vízmintáit (Balaton, Velencei-tó, Kis-Balaton tározó, Zámolyi-tározó) használtuk fel. Eredmények: 1. táblázat: A párhuzamos a-klorofill vizsgálatok eredményei a két használt módszer esetében (Felföldy-msz. : membránszűrő, MSZ-ISO: üvegszűrő) a-ldorollll koncentrációk (mg/m j Minta sorsz. Felfdldy-módszer MSZ-ISO 23 20,7 20,3 12,9 13,9 24 31,7 34,4 16,5 14,7 16,9 25 519 490 341 333 320 26 39,4 40,4 27 14,2 14,5 15,7 9,8 V 7,6 28 12,5 13,1 10,3 11,6 9,9 11,0 29 18,5 18,9 18,1 13,6 13,7 13,0 C A: a-klorofill koncentráció (mg/m')
