Fogorvosi szemle, 2017 (110. évfolyam, 1-4. szám)
2017-03-01 / 1. szám
8 FOGORVOSI SZEMLE ■ 110. évf. 1. sz. 2017. Vizsgálati anyag és módszerek Kísérleti állatok A Semmelweis Egyetem NET akreditált állatházából származó Charles River eredetű 350-400 g testsúlyú, Crl(Wi)Br Wistar patkányokat használtunk. Az állatokat a kísérleti periódusban légkondicionált állatházban gondoztuk, életritmusuknak megfelelő fényciklusban, ad libitum folyadék és táplálék biztosításával. A kísérleti anesztéziát intraperitoneálisan adott (ip.) sodium pentobarbital (Nembutal 40 mg/tskg) injekcióval biztosítottuk. A kísérleti periódus végén az állatokat altatásban, az artéria abdominalis átvágásával elvéreztettük. A kísérleti módszer etikai engedélyszáma 1799/003/ 2004. Fogpulpa eredetű őssejtek izolálása, tenyésztése és oszteogén differenciálása Felnőtt páciensekből impaktált humán bölcsességfogakat gyűjtöttünk a Semmelweis Egyetem klinikáin. A humán DPSC izolálása és tenyésztése a korábban leírtak alapján történt [15, 18, 19]. Ehhez hasonlóan a korábban leírt izolálási módszereinket alkalmaztuk patkány metszőfog pulpasejtjeinek izolálása során is [15, 17, 19]. Mindkét sejtizolálásnál steril körülmények között dolgoztunk, a pulpakamra feltárása után a mechanikus aprítást ollóval és szikével óra-üvegen végeztük. A kezdő emésztést a-MEM tápoldatban 1 mg/ml koncentrációjú kollagenáz-l enzimmel végeztük (Sigma) 37 °C-on 1 órán át, 10 percenkénti intenzív rázás (Vortex) mellett. A sejteket 250 g x 5 perc centrifugálással koncentráltuk. Az üledéket tápoldattal tenyésztőedényekbe mostuk. A sejttenyésztő-tápoldat (a-MEM medium) összetétele a következő volt: 10%-os fetal bovin serum (FBS-Gibco), 2 mM L-glutamin (Sigma), 100 pg/ml Streptomycin (Sigma), 100 U/ml penicillin (Sigma), 50 pg/ml aszkorbinsav-2-foszfát. A sejtek tenyésztése 5% C02 standard thermostat gáztér környezetben, 37 °C hőmérsékleten történt. Tápcsere heti 2x, valamint passzálás hetente 1 x: 0,05% Tripszin- EDTA (Gibco) oldattal. Oszteogén-tápoldatot a fogpulpa mesenchymalis őssejtek oszteogén irányú differenciálására használtunk [15, 17, 19]. Az a-MEM tenyésztő médiumot 1 %-osra csökkentett FBS-el valamint: 10‘8M Dexametazon, 50 pg/ml L-aszkorbinsav-2-foszfát, 10 mM ß-glicerofoszfät anyagokkal egészítettük ki. A sejteket hetente passzáltuk, közben morfológiai változásaikat fáziskontraszt mikroszkópos fényképezéssel rögzítettük. A beültetéshez különböző sejtszámokat használtunk. A beültetés előtt a sejtek vagy nem részesültek előkezelésben, vagy 4 órán át oszteogén médium alkalmazásával végeztük el az elődifferenciáltatásukat. Patkány farokcsigolya (OSSI-modell) műtéttechnika Speciális mini implantátumokat használtunk. Grade 3 típusú titán-szálból esztergált-homokfúvott csavarok 1,0 mm mag átmérővel és lapított 2,5 mm átmérőjű fejjel, melyen centrálisán 1,0 mm átmérőjű lyuk szolgál a kitépési erőmérő csatlakoztatására (gyártó: Full-tech Kft.). (1. ábra) A patkányfarok bőrfelületét vizes lemosással tisztítottuk, majd 3x15 perces dezinficiáló oldatos (Clarasept-derm, Uniclean Kft., Budapest) áztatással fertőtlenítettük. Vérzéscsillapítás végett a farok tővénél kettős ligatúrát alkalmaztunk a műtét idejére. Steril, egyszerhasználatos takarókendővel történt a műtéti terület izolálása. Állatonként külön-külön sterilizált eszközkészlettel dolgoztunk. A farki 4-5. csigolya ízesülésétől disztálisan 6-8 mm-re körmetszéssel szétválasztottuk a bőrt - ezt kissé visszahúzva -, a csigolyákat egymástól az ízületnél elválasztottuk. A porcfelülettel borított, szabaddá váló csigolyatestet tengely irányban centrálisán 1,0 mm átmérőjű fúróval 8 mm mélyen előfúrtuk, majd egy következő, 2,0 mm átmérőjű fúróval 5 mm mély kavitássá tágítottuk. Ez adja a standard határokkal bíró 5 mm mély 2 mm átmérőjű csontosodási kazettát (1. ábra). Ez a művi csontüreg lehetőséget ad a csontosodási folyamat morfológiai nyomon követésére, valamint intraosszeális implantátum in situ behelyezését követően az implantátum osszeointegrációs folyamata biofizikai erőméréssel is vizsgálható. Ugyancsak a csontüreg és az implantátum közötti tér ad lehetőséget különböző vizsgálati anyagok, úgymint sejteket tartalmazó médiumok behelyezésére az osszeointegráció modifikálásának vizsgálatára (1. ábra). A farokcsigolya centrális furatába helyeztük az implantátumot, melyet első harmadában a csontszövet rögzíti. A behelyezés mélységi kontrollját, a stift feje, illetve a rajta lévő furat adta. A fej csavartest felőli válla a furat szélén felfekszik, így centralizálva a csavart annak mélységi standardját is beállítja, melynek kontrollja a fején kialakított furat, amelynek egy síkba kell kerülnie a porcfelszínnel. A farokbőrt ráhúzva az implantátumra, zsáköltéssel atraumatikusan, de áteresztésmentesen zártuk, a bőrfelületet Braunol oldattal fertőtlenítettük és egy vékony fedőhártyával izoláltuk (Plastubol®, methylmethacrylatbutylacrylat-butylmethacrylat, diisooctyl phtalate - Pannonpharma Kft., Magyarország). Az állatokat ébredésig testhőmérsékleten tartottuk. A kísérleti periódus első két hetét az állatok egyedi ketrecekben töltötték, fokozott higiénia biztosításával. A farok sebgyógyulása után a szocializációs igények helyreállítására visszahelyeztük állatainkat közös csoportjukba, ahol még 6 hétig tartottuk állatainkat. A csontregeneráció vizsgálatára előzetes eredményeink alapján [5] nyolchetes intervallumot választottunk. A kísérleti csoportok összeállítása a következő volt: valamennyi csoportban azonos körülmények között előkészített patkányfarok osszeointegrációs rendszerben (OSSI modell) a csigolyába fúrt csontosodási kazettába kerültek a 10-10 pl-es médiumok, különböző öszszetételben: B csoport sejtmentes a-MEM tápoldat, C csoport 15 ezer patkány DPSC őssejt (kis sejtszám), D csoport 100 ezer DPSC őssejt (nagy sejtszám), Ecsoport sejtmentes a-MEM oszteogén tápoldat, E2 csoport
